OPTIKAI SPEKTROSZKPIA 2008 1 1 Festkprbk az anyagtudomnyban

OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA 2008 1. 1. Festékpróbák az anyagtudományban (KM) 1. 2. Fluoreszcencia-mikroszkópia (VT) 1. 3. Fotodinamikus terápia (VT) 1. 4. Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia (PK) 1. 5. Fotokróm anyagok (BP) 1. 6. Optikai érzékelők (KM) 1

Joseph Fraunhofer kísérlete 1815 A Nap fényét optikai rácson felbontotta. A folytonos színképben fekete vonalakat észlelt. 2

3

Erwin Schrödinger: Quantisierung als Eigenwertproblem (1926) 4

EGYSUGARAS UV-LÁTHATÓ ABSZORPCIÓS SPEKTROMÉTER 5

Festékpróbák A mikrokörnyezetről adnak információt, például egy sejten belül. A mért paraméter pl. polaritás, viszkozitás, hőmérséklet, diffúzió-sebesség. Abszorbeáló próbák Fluoreszkáló próbák 6

Abszorbeáló próba – polaritás mérése Reichardt’s dye 7

Reichardt’s dye „charge transfer” festék 8

Oldószer polaritás S 1 = 810 nm Ph-O-Ph = 453 nm H 2 O S 0 9

skála Az oldószer polaritását jellemzi. 10

Szolvatokromizmus: a szín függ az oldószertől 11

Szolvatokromizmus: a szín függ az oldószertől Termokromizmus: A szín függ a hőmérséklettől Etanolban + 78 C max = 568 nm - 78 C max = 513 nm 12

Szolvatokromizmus: a szín függ az oldószertől Termokromizmus: A szín függ a hőmérséklettől Etanolban + 78 C max = 568 nm - 78 C max = 513 nm Piezokromizmus: A szín függ a nyomástól Etanolban 1 bar max = 547 nm 10 kbar max = 520 nm 13

Abszorbeáló festékpróba CDspektroszkópiai alkalmazása 14

Példa biológiai CD vizsgálatra: DNS vizsgálata akridin naranccsal AN Az AN „interkalációs” komplexet képez Indukált CD: nem királis festékmolekula királis környezetben CD jelet ad. 15

AN – DNS rendszerek CD spektruma A hozzáadott DNS konc. -ja változik c. A 0 = 10 -5 M Ha kevés a DNS, sok dimer, amit az exciton sávpár jelez. D. Fornasiero, J. Phys. Chem. 85, 613 (1981) 16

A fluoreszcenciamérés előnyei az abszorpcióméréssel szemben 1. Nem kell átlátszó minta 2. Nagyobb érzékenység 3. Háromszoros szelektivitás - gerjesztési hullámhossz szerint - emissziós hullámhossz szerint - lecsengési idő szerint Hátrány: a vegyületeknek csak kis hányada fluoreszkál 17

Fluoreszcens festékpróbák 18

Oxazin 1 N C 2 H 5 O N + C 2 H 5 Cl. O 4 19

Oxazin 1 UV-látható abszorpciós spektruma Abszorbancia 2, 5 2 1, 5 1 0, 5 0 200 400 600 800 Hullámhossz (nm) 20

Oxazin 1 + receptor 21

22

Stacionárius fluoreszcencia módszerek Kioltás Oldószer-függés Hőmérsékletfüggés 23

24

Statikus kioltás 25

Oxazin 1 + receptor 26

27

28

Dinamikus kioltás 29

30

31

Dinamikus kioltás M + h M* M+ M+Q 32

A dezaktiválódás sebessége és fluoreszcencia-hatásfoka Kioltó nélkül Kioltóval 33

Stern-Volmer egyenlet 34

Statikus kioltás 35

Statikus és dinamikus kioltás megkülönböztetése - τF din. -nál változik, stat. -nál nem 36

Oldószer polaritása és hőmérséklete 37

Oldószer polaritás S 1 S 0 38

S 1 vibrációs relaxáció emisszió abszorpció S 0 39

S 1 vibrációs relaxáció oldószer relaxáció emisszió abszorpció S 0 oldószer relaxáció 40

S 1 vibrációs relaxáció 10 -12 s oldószer relaxáció 10 -10 s emisszió 10 -9 s abszorpció 10 -15 s S 0 oldószer relaxáció 41

S 1 vibrációs relaxáció 10 -12 s oldószer relaxáció 10 -10 s emisszió 10 -9 s abszorpció 10 -15 s S 0 oldószer relaxáció 42

S 1 vibrációs relaxáció 10 -12 s oldószer relaxáció 10 -10 s emisszió 10 -9 s abszorpció 10 -15 s S 0 oldószer relaxáció 43

Patman CH 3 CH 2 CH 3(CH 2)14 + CH 2 N(CH 3)3 C O 44

Lakowicz, p. 199 Poláris oldószer stabilizálja a gerj. állapotot 45

IF 400 Lakowicz, p. 199 500 [nm] Az oldószer-relaxáció csökken, ha T csökken 46

Kettős fluoreszcencia DMANCN fl. Színképe etilénglikolban Lakowicz, p. 201 47

Acrylodan H O H H 3 C N H CH 3 48

Zsírsavkötő fehérje működésének vizsgálata Lakowicz, p. 202 Kovalensen kötött „címke” 49

DOS CH 3 N CH 3 C (CH 2)3 CH 3 O 50

DOS korrigált fluorszcenciaspektruma ciklohexánban (CH), toluolban (T), etilacetátban (EA), butanolban (Bu), DPPC vezikulákban (----) Lokális polaritás vezikulában Lakowicz, 186. o. 51

Polaritás hatása: Lippert-egyenlet ---+ G v. E _ ++++ 2 a 52

Lippert-egyenlet ---+ _ ++++ G v. E 2 a 53

Naftilamin-származékok Stokes eltolódása Lakowicz, p. 191 54

Fluoreszkáló aminosavak fenil-alanin tirozin triptofán 55

Triptofán abszorpciós és emissziós spektruma (víz, p. H 7) Lakowicz, p. 446 56

A triptofán környezetének hatása fehérjék fluoreszcencia spektrumára 1) Apoazurin Pfl 2) T 1 ribonuklease Lakowicz p. 453 3) staphillococcus nuclease 4) glucagon 57

Rezonancia energia-átadás (Förster resonance energy transfer = FRET) Távolságmérés fluoreszcenciával! Mikroszkóppal a hullámhossztól függő, UVfénnyel ~ 200 nm-es felbontás érhető el FRET: 2 -10 nm-es távolságok érzékelhetők 58

Donor festék – akceptor festék, D fluoreszc. tartománya átfed A absz. tartományával. 59

Ha D és A távolsága kicsi, FRET, D-t gerjesztve az A fluoreszkál A hatás 1/r 6 -nal arányos 60

Példa: DNS –foszfolipid kölcsönhatás vizsgálata C. Madeira, Biophys. J. 85, 3106 (2003) 61

Akceptor Donor: Et. Br (etidium bromid) 62

BODIPY fluoreszcencia Et. Br abszorpció 63

Fehérjék konformáció-változását lehet FRET-tel követni 64

Időfelbontásos fluoreszcencia-spektroszkópia 65

Időkorrelált egyfoton-számlálás 66

Fluoreszcencia lecsengési görbe 67

Fázismodulációs módszer Folytonos lézer amplitúdóját szinuszosan moduláljuk. Int. F fluoreszcencia t w·t = tg F 68

Fázismodulációs mérőrendszer Folytonos lézer Modulátor Minta Referencia jel Lock-in ( fázisérzékeny detektor) szűrő Monokromátor PMT 69

Oldószer-relaxáció hatása a fl. spektrumra Lakowicz, 213. o. 70

Festékmolekula orientációs relaxációja ---+ G v. E _ ++++ 2 a 71

Hidrodinamikai súrlódás járuléka Stokes-Einstein-Debye egyenlet 72

Dielektromos súrlódás járuléka 73

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán Habuchi et al. , (Sapporo), Anal. Chem. 73, 366 -372 (2001) Gyanta: sztirol - divinilbenzol kopolimer Keresztkötések gyakorisága ( ) 8 % divinilbenzol Ioncserélő csoport: Na-szulfonát 74

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán 75

Irodalom 1. J. R. LAKOWICZ, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2 nd Edition, Kluwer Academic, London, 1999 2. C. REICHARDT, Chem. Rev. 94, 2319 -2358 (1994) 3. M. KUBINYI, A. GROFCSIK, I. PÁPAI, W. J. JONES, Chem. Phys. 286, 81 -96 (2003) 4. S. KULMALA, J. SUOMI, Anal. Chim. Acta 500, 21 -69 (2003) 5. F. V. BRIGHT, C. A. MUNSON, Anal. Chim. Acta 500, 71 -104 (2003) 76