III Konferencja NaukowoSzkoleniowa Zakaenia Ukadu Oddechowego 20 22

III Konferencja Naukowo-Szkoleniowa „Zakażenia Układu Oddechowego” 20 -22 października 2006 NOWE METODY DIAGNOSTYKI GRUŹLICY Hanna Grubek-Jaworska Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie

o Około 80% zachorowań na gruźlicę wykrywa się z objawów o Jedynym, niepodważalnym potwierdzeniem wstępnego rozpoznania choroby jest uzyskanie dodatnich wyników diagnostyki mikrobiologicznej. o W 2005 r. wśród nowo zarejestrowanych (9 280) jedynie u 5 409 potwierdzono gruźlicę bakteriologicznie (58, 3 %), wśród chorych na gruźlicę płuc 61, 2 %

Specyfika laboratoryjnej diagnostyki gruźlicy wiąże się z: o o niskim tempem namnażania się prątków na pożywkach koniecznością stosowania wielu technik wykrywania zakażenia mikroskopia techniki hodowlane przyspieszające wzrost techniki molekularne

Prawidłowa laboratoryjna diagnostyka gruźlicy obejmuj o bakterioskopię o wyhodowanie prątków o określenie gatunku wyhodowanych prątków o określenie lekowrażliwości

o Miarą nowoczesności laboratorium diagnostyki gruźlicy jest spełnienie powyższych wymogów diagnostycznych w maksymalnie krótkim czasie o Docelowo całość diagnostyki nie powinna przekraczać 21 - 25 dni

Laboratoria prątka gruźlicy I Rzędu: mikroskopia II Rzędu: hodowla identyfikacja M. tuberculosis complex ocena lekowrażliwości na INH, RMP, SM, EMB III Rzędu: identyfikacja ważniejszych gatunków prątków testy lekowrażliwości dla leków drugiej linii testy lekowrażliwości dla prątków atypowych

Nowoczesna laboratoryjna diagnostyka gruźlicy o bakterioskopia uzupełniona o metody molekularne o wyhodowanie prątków pożywka L-J pożywki płynne z różnymi systemami detekcji o określenie gatunku wyhodowanych prątków konwencjonalne metody bioch. -mikrobiologiczne metody molekularne analiza kwasów mikolowych techniką HPLC o określenie lekowrażliwości metody fenotypowe metody molekularne?

Mycobacterium sp. barwienie metodą -Neelsena mikroskopia w świetle widzialnym barwienie auraminą mikroskopia w świetle UV

obecność prątków O 1 -2 / 300 pól widzenia 1 -9 / 100 pól widzenia 1 -9 / 10 pól widzenia 1 -9 / 1 pole widzenia > 9 / 1 pole widzenia wynik Prawdopodobnie negatywny (nie wystarczająca liczba prątków dla wykrycia w bekterioskopii) Nie uznawany za pozytywny, konieczność badania dalszych próbek + (sporadyczne) ++ (nieliczne) +++ (średnio liczna) ++++ (liczne) */ przy powiększeniu 800 x - 1000 x

B a k t e r i o s k o p i a (+) (-) Wykrywa chorych silnie prątkujących Nie różnicuje prątków żywych i martwych Czas wykonania około 3 godzin Nie różnicuje gatunku prątków Niska cena badania Czułość w wykrywaniu gruźlicy w plwocinie około 30 %

AFB (+) M. Tuberculosis NTM (MOTT) 30 - 40% 60 – 70%

Chorzy - mikroskopia dodatnia (n = 217) Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii (1999 -2005) mykobakteriozy n=9 (7%) TB n = 82 (38%) NTM n = 135 (62%) NTM środowiskowe lub kolonizacja n = 126 (93%) potwierdenie TB wykluczenie TB testem MTB

Przy wynikach AFB(+) zalecanym postępowaniem jest wykonanie (możliwie z tej samej próbki klinicznej) badania techniką molekularną, która pozwala zidentyfikować genom prątków gruźlicy

Systemy molekularne dopuszczone do rutynowej diagnostyki gruźlicy o Amplicor (MTB) test (Roche Molecular System, Somerville, New Jersey) rozpoznaje M. tuberculosis complex PCR (6 – 8 godz) o Mycobacterium tuberculosis Direct Test (MTD) (Gen-Probe Inc. San Diego, Ca) rozpoznaje M. tuberculosis complex, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. gordonae, r. RNA (2 – 3 godz) o BDProbe Tec ET Mycobacterium tuberculosis complex Direct Detection Assay (SDA - Strand Displacement Amplification) (Becton Dickinson Biosciences, Sparks, Md. ) rozpoznaje M. tuberculosis complex, M. avium complex oraz M. kansasii SDA (1, 5 godz)

Metody biologii molekularnej (+) Czas wykonania badania – kilka / kilkanaście godzin Czułość wykrywania gruźlicy około 70 - 90 % (-) Stosunkowo wysoka cena badania Szkolenie, aparatura Możliwość identyfikacji jedynie 5 gatunków Swoistość 97 -100 % prątków: Wykrywanie zakażeń w • M. tbc complex, bardzo wczesnej fazie • M. avium, • M. intracellulare, • M. konsasii, • M. gordonae Jedynie metodą molekularną można w czasie kilku godzin wykryć obecność prątków gruźlicy bezpośrednio w materiale klinicznym

Amplicor Próbka kliniczna 103 - 10 4 MTB PCR (Roche) Dekontaminacja Zagęszczanie Izolacja DNA 101 - 10 2 PCR Wykrycie produktów reakcji

o W zakresie diagnostyki gruźlicy, czułość i swoistość wymienionycvh systemów molekularnych jest porównywalna o W rutynowej diagnostyce gruźlicy nie należy stosować metod ”domowych” o Próbki kliniczne mogą być przesyłane pocztą (do 5 dni) bez utraty wartości diagnostycznej w zakresie zakażeń prątkowych

REKOMENDACJA CDC próbka mikroskopowo dodatnia amplifikacja pozytywna 1 x TB amplifikacja negatywna 2 x inhibicja obecna badanie następnych próbek brak mykobakterioza ?

REKOMENDACJA CDC próbka mikroskopowo ujemna amplifikacja negatywna 2 x nie TB amplifikacja pozytywna 2 x TB amplifikacja zahamowana ?

Chorzy na gruźlicę (1999 -2005) metoda i wynik AFB (+) hodowla (+) Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie (1999 -2005) liczba chorych 62 AFB (-) hodowla (+) 51 AFB (+) hodowla (-) 20 * AFB (-) hodowla (-) 9* ogółem * dodatni test molekularny (MTB) 142 w próbkach 9 / 51 chorych wynik testu MTD był ujemny czułość mikroskopii 58% czułość hodowli 79%

Systemy detekcji wzrostu prątków na pożywkach płynnych o radiometryczny Bactec 460 Tb (Becton Dickinson) (możliwość różnicowania M. Tbc / NTM) o kolorymetryczny system - MB Bac T (Organon Teknika Corporation) (możliwość badania lekooporności na podstawowe leki przeciwgruźlicze, osobne podłoża dla próbek krwawych) o system fluorymetryczny MGIT (Mycobacterial Growth Indicatory Tube) (Beckton Dickinson) (możliwość badania lekooporności na podstawowe leki przeciwgruźlicze)

wyhodowane prątki M. Tuberculosis NTM (MOTT) 30 - 40% 60 – 70%

Chorzy – hodowle dodatnie (n = 312) (1999 -2005) Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii) mykobakteriozy n = 22 (11%) TB n = 113 (36%) potwierdzenie TB testem MTB lub techniką HPLC NTM n = 199 (64%) wykluczenie TB testem MTB, typowanie gatunku HPLC NTM środowiskowe lub kolonizacja n = 170 (89%) M. xenopi n = 57 M. kansasii n = 42 M. gordonae n = 33 M. avium n =10 M. abscseus n=9 M. fortuitum n=8 M. flavescens n=1 M. scrofulaceum n=1 M. neoaurum n=1 M. nonchromogenicum n = 1 unidentified sp. n=9

HPLC (high pressure liquid chromatography) M. tuberculosis Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa LMW HMW Analiza składu kwasów mykolowych: M. avium LMW 1. Hydroliza 2. Ekstrakcja chloroformem 3. Przekształcenie kwasów mykolowych w bromofenacylowe pochodne 4. Rozdział na kolumnie w fazie odwróconej HMW M. interjectum 5. LMW HMW 5. Wzór elucyjny badanej próby 6. Analiza porównawcza z biblioteką zgromadzonych wzorów elucyjnych szczepów wzoprcowych z ATCC

Porównanie czułości i czasochłonności metod laboratoryjnych w wykrywaniu gruźlicy czułość czasochłonność (%) metody molekularne hodowla mikroskopia 70 – 90 70 33 – 50 1 dzień kilka dni - 8 tyg 3 - 4 godz

próbka kliniczna (po wstępnym opracowaniu) metoda molekularna bakterioskopia hodowla Tbc ujemna nie Tbc bk - bk+ wynik 24 h dodatnia test niacynowy lub metody HPLC molekularne wynik • MAC • kilkadziesiąt gatunków prątków • M. kansasii • M. tuberculosis lekooporność met. hodowlane lub met. molekularne kilkanaście dni do 10 tyg. wynik kilka godzin do 40 dni

Ujemne wyniki badań laboratoryjnych nie wykluczają rozwoju choroby bowiem żadna z metod laboratoryjnych nie charakteryzuje się 100% czułością

Najczęstsze błędy laboratoryjne i interpretacyjne lub zaniechania w mikrobiologicznej diagnostyce gruźlicy

I Jednoznaczna interpretacja mikroskopii AF (+) jako gruźlicy, AFB (+) może wskazywać o gruźlicę o saprofit środowiskowy – (NTM / MOTT) o mykobakterioza o w przypadku materiałów bronchoskopowych zanieczyszczenie instrumentarium

II Brak typowania do gatunku wyrośniętych szczepów prątków - poprzestanie na wykonaniu testu niacynowego różnicujacego jedynie M. tbc oraz MOTT nie pozwala to na: o diagnozowanie mykobakterioz o wykrywanie systematycznych zanieczyszczeń prątkami środowiskowymi

III Zaniechanie wzywania na dodatkowe badania mikrobiologiczne chorych ze wskazaniami klinicznymi, u których wyhodowano prątki niegruźlicze Z tej grupy rekrutują się chorzy na mykobakeriozy

IV Brak systematycznej oceny mikrobiologicznej czystości sprzętu endoskopowego

Immunologiczna diagnostyka zakażenia M. tuberculosis w warunkach in vitro Diagnostyka uśpionych zakażeń M. tbc Latent Tuberculosis Infection - LTBI

Odpowiedź na zakażenie M. tuberculosis nasilenie odpowiedzi cell mediated immunity przeciwciała replikacja prątków L a t e n t TB I n f e c t i o n czas zakażenie choroba

Zjawisko, które było podstawą współcześnie stosowanego testu tuberkulinowego opisał w 1890 roku Robert Koch, kontynuatorami jego pracy byli Charles Mantoux i Clemens von Pirquet skórny test tuberkulinowy (tuberculin skin test -TST) stosowany jest od 1907 roku.

test skórny pomiar testu tuberkulinowego IFN-γ stymulacja IL- 8 TNF- komórka prezentująca antygen komórka pamięci IFN-γ TNF- krew - test in vitro pomiar produkcji IFN-γ IL- 8

Czynniki negatywizujące TST: o Zależne od osoby badanej infekcje (wirusowe, bakteryjne, grzybicze) zaburzenia metaboliczne niedożywienie choroby narządów limfatycznych(np. . białaczka, sarkoidoza) leki (glikokortykoidy, leki immunosupresyjne) wiek o Zależne od preparatu tuberkulinowego nieodpowieednie rozcieńczenie chemiczna denaturacja adsorpcja na szkle kontaminacja o Zła technika szczepienia o Zła technika odczytu

ekspozycja na M. tbc zakażenie 95 % zakażanie uśpione 95 % nie dochodzi do rozwoju choroby 90% brak dowodów zakażenia 5% gruźlica 5% 5 -10 % wg E. Tortoli 2005

o Postępy immunologii i genomiki ostatnich lat stworzyły test alternatywny dla skórnego testu tuberkulinowego o Jest to test in vitro nowej generacji mierzący poziom odporności komórkowej o Podstawą testu jest oddziaływanie na komórki w warunkach in vitro wysoko swoistych dla M. tuberculosis antygenów ESAT-6 oraz CP-10 stymulujących wydzielanie IFN-gamma

ESAT-6 - early secretory antigenic target 6 CP-10 - culture filtrate protein Antygen ESAT-6 M tuberculosis BCG moreau pasteur tokyo danish glaxo montreal + - niskocząsteczkowe białka swoiste dla M. tuberculosis NTM CFP-10 + - Antygen M abscessus M avium M branderi M celatum M chelonae M fortuitum M gordonae M intracellulare M kansasii M malmoense M marinum M genavense M scrofulaceum M smegmatis M szulgai M terrae M vaccae M xenopi + + + - ESAT-6 + + + -

Quanti. FERON -TB Gold Maj 2005 – test uzyskał aprobatę FDA U. S. Badanie polega na wykrywaniu IFN-gamma w hodowlach limfocytów heparynizowanej, pełnej krwi stymulowanych syntetycznymi peptydami: ESAT-6 (early secretory antigenic target-6) CFP-10 (culture filtrate protein-10) swoistymi dla M. tuberculosis oraz patogennych szczepów M. bovis. Białek ESAT-6 oraz CFP-10 nie stwierdza się w BCG oraz w większości gatunków prątków środowiskowych z wyjątkami M. kansasii, M. szulgai, M. marinum Test jest rekomendowany przez CDC w każdej sytuacji, w której wykonuje się TST włączając gruźlicę oraz kontakty z TB (Latent Tuberculosis Infection -LTBI) CDC MMWR Recomendations and Reports Dec 16, 2005/54 (RR 15; 49 -55)

Quantiferon metoda probówkowa 1 krew inkubacja 16 - 24 h w 37°C kontrola ujemna ESAT 6 + CFP 10 mitogen wirowanie 2 badanie plazmy w teście ELISA wykrywającym IFN-γ DO 450 nm kolor dodanie substratu – pomiar kolorymetryczny IFN-g IU/ml odczytanie stężenia z krzywej standardowej

I etap – inkubacja leukocytów z antygenem, zebranie nadsączu krew + antygen kontrole: krew bez Ag krew + mitogen Inkubacja w 37 16 -24 godz. wirowanie, 2000 g przez 5 -10 min pobranie 200 μl plazmy ELISA – IFN-γ konjugat + badana plazma lub standard inkubacja min płukanie, 120 dodanie substratu dodanie roztworu stopującego odczytanie stężenia z krzywej standard.

Quantiferon – metoda płytkowa K pobranie krwi ESAT-6 CFP-10 mitogen krew + antygeny inkubacja 24 h , wydzielenie IFN-γ DO 450 nm KOLOR IFN-g IU/ml ‘sandwich’ ELISA, (incubacja 120 min) dodanie substratu, reakcja barwna odczyt stężenia IFNγ z krzywej standardowej

Quanti. FERON TB Gold – interpretacja wyników miogen – K ESAT 6 – K i / lub CFP 10 – K 0, 5 0, 35 pozytywny zakażenie prawdopodobne < 0, 5 0, 35 pozytywny zakażenie prawdopodobne 0, 5 < 0, 35 negatywny zakażenie nieprawdopodobne < 0, 5 < 0, 35 nieokreślony brak wyniku IU IFN- γ /ml wynik interpretacja

T SPOT- TB assay metoda ocena liczby komórek syntetyzujących IFN-γ kontrola pobranie krwi separacja leukocytów jednojądrzastych ESAT-6 CFP-10 mitogen inkubacja komórek stymulowanych antygenami w naczyniach opłaszczonych przeciwciałem anty IFN-γ k. OLOR inkubacja 24 h w 37 o. C ‘sandwich’ ELISA, (Ink Inkubacja 120 min) ocena liczby barwnych plamek

T SPOT- TB assay 1 Zawiesinę leukocytów krwi (250 000/ml) nawarstwia się na płytkę opłaszczoną przeciwciałem anty IFN-γ, dodaje antygeny swoiste dla TB uwalniany IFN-γ wychwytywany jest przez przeciwciała 2 Po odpłukaniu dodaje się wtórne przeciwciało znakowane enzymem, a nstępnie substrat, co wizualizuje test plamki barwne (1 plamka = 1 komórka T)

Jeżeli w kontroli negatywnej. >10 lub kontroli pozytywnej <20 test nie może być interpretowany

Korelacja IFN-γ / Mantoux czułość swoistość IFN-γ Mantoux 89. 0% 65. 7% (105/118) (50/76; 5 mm) 98. 2% 35. 4% (213/217) (73/113; 10 mm) Mori et al Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2004

FIG. 1. Individual IFN- response to PPD and either of the RD 1 antigens ESAT-6 or CFP-10 (E 6/C 10) (for each patient the highest IFN- responses) are shown. In the left panel, the responses of the TB suspect population (n = 73); and in the right panel, the responses for the healthy control population (n = 39). The cutoff value for a positive response was set at 0. 35 IU/ml for ESAT-6 and CFP-10 and arbitrarily at 1. 5 IU/ml for PPD. The dotted lines represent the cutoff for the specific antigens and PPD. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, April 2005, p. 491 -496, Vol. 12, No. 4

cutoff of 0. 35 IU/ml for IFN- γ T. Mori i wsp. Am J of Respir Crit Care Med Vol 170. pp. 59 -64, (2004)

Ograniczenia metodyczne Quantiferonu- TB Gold (błędy techniczne) o użycie innych antykoagulantów niż heparyna o nieodpowiedni transport krwi o zbyt wysoke stężenie IFN-gamma we krwi o czas > 12 godzin po pobrania krwi

Ograniczenia merytoryczne Quantiferonu- TB Gold o test nie powinien być stosowany w przypadkach zaniżonej liczby limfocytów o w przypadkach upośledzonej reaktywności immunologicznej (HIV, AIDS, transplantacje, immunosupresja polekowa) o u kobiet w ciąży o u osób poniżej 17 r. ż.

kierunki badań: o QFT-G u dzieci, szczególnie <5 r. ż. o QFT-G u osób z zaburzeniami układu odpornościowego o czułość testuw gruźlicy pozapłucnej o przypadki TB w następstwie wykluczenia lub potwierdzenia LTBI przez QFT-G o czas po ekspozycji na M. tbc niezbędny dla pozytywizacji QFT-G o analiza ekonomiczna stosowania TST vs QFT-G o zmiany QFT-G u chorych leczonych z powodu LTBI oraz TB – monitorowanie terapii

W diagnostyce rutynowej wiele spośród wspomnianych nowszych technik mogą stosować jedynie wybrane laboratoria Techniki te stanowią w wielu przypadkach jedynie uzupełnienie metod konwencjonalnych Zaleca się łączenie nowych technik z diagnostyką tradycyjną

dziękuję za uwagę