DIPARTIMENTO DI MEDICINA EPIDEMIOLOGIA IGIENE DEL LAVORO ED

DIPARTIMENTO DI MEDICINA, EPIDEMIOLOGIA, IGIENE DEL LAVORO ED AMBIENTALE Laboratorio Rischio Agenti Biologici LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI Antonella Mansi Giornata di Studio dedicata alla presentazione dei risultati del progetto BIC 2016 – ID 12 Progettazione e Sviluppo di un Sistema Sensoriale per la Misura di Composti Volatili e la Identificazione di Microrganismi di Interesse Occupazionale 25 Ottobre 2019 Aula Magna dell'Università di Roma Tre Viale Ostiense 159, Roma

PIANO TRIENNALE DELLE ATTIVITÀ DI RICERCA (2019 -2021) RICERCA ISTITUZIONALE RICERCA SCIENTIFICA E’ la ricerca regolata da specifiche normative (Amianto, Attività di certificazione e verifica, Attività di monitoraggio, Consulenza e Supporto tecnico normativo, etc. ) E’ una attività di ricerca proposta dai ricercatori all’interno del Piano di Attività svolta in collaborazione con i destinatari istituzionali (Enti di ricerca pubblici, Università, IRCCS) del bando BRIC BANDO RICERCHE IN COLLABORAZIONE (BRIC) DESTINATARI ISTITUZIONALI LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI

DIREZIONE CENTRALE RICERCA Dipartimento di Medicina, Epidemiologia, Igiene del Lavoro ed Ambientale (Di. MEILA) Laboratorio «Rischio Agenti Biologici» (Responsabile: Dott. ssa P. Tomao) Dipartimento Innovazioni Tecnologiche e Sicurezza degli Impianti, Prodotti e Insediamenti Antropici (DIT) ZOONOSI VACCINI ALLERGIE n. 9 Ricercatori MARKERS ESPOSIZIONE AGENTI BIOLOGICI n. 4 CTER SVILUPPO E STANDARDIZZAZIONE DI METODI EMERGENZE SANITARIE INFETTIVE ANTIBIOTICO RESISTENZA

ATTIVITA’ DI RICERCA L’attività di ricerca si concentra sui seguenti aspetti: - ricerca, studio e sperimentazione per il rilevamento e la valutazione qualiquantitativa di agenti biologici in matrici ambientali (aria, acqua, suolo, polvere) attraverso metodologie tradizionali e innovative; - individuazione di markers di esposizione ad agenti biologici e valutazione della suscettibilità individuale nei confronti di allergeni aerodiffusi; - studi sull’efficacia antimicrobica di materiali e sistemi innovativi per il controllo della contaminazione microbiologica; - Sviluppo e standardizzazione di metodi di campionamento e di analisi; - individuazione di criteri di valutazione dell’esposizione ad agenti patogeni attraverso studi epidemiologici e di misure di prevenzione (comportamentali, DPI, pratiche vaccinali, ecc. ) anche in scenari di emergenze sanitarie di origine infettiva (zoonosi emergenti, fenomeno dell’antibiotico-resistenza) 4

VALUTAZIONE DEL RISCHIO BIOLOGICO IN AMBIENTI DI LAVORO PROBLEMATICHE TECNICO-OPERATIVE INTERPRETAZIONE DEI DATI PROCEDURA VALUTAZIONE DEL RISCHIO Attività lavorative con uso deliberato di microrganismi Attività lavorative con rischio potenziale di esposizione Laboratori microbiologia, laboratori di ricerca, industrie farmaceutiche, etc LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI 5

D. Lgs 81/2008 Titolo X - Esposizione ad agenti biologici Capo I art. 267 Definizioni MALATTIE INFETTIVE EFFETTI TOSSICI ALLERGIE Agente biologico: qualsiasi microrganismo anche se geneticamente modificato, coltura cellulare ed endoparassita umano che potrebbe provocare infezioni, allergie o intossicazioni. Microrganismo: qualsiasi entità microbiologica, cellulare o meno, in grado di riprodursi o trasferire materiale genetico Coltura cellulare: il risultato della crescita in vitro di cellule derivate da organismi pluricellulari LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI

PROCEDURA DI VALUTAZIONE DEL RISCHIO Titolo X Capo II - OBBLIGHI DEL DATORE DI LAVORO Articolo 271 - Valutazione del rischio Il datore di lavoro, nella valutazione del rischio di cui all’articolo 17, comma 1, tiene conto di tutte le informazioni disponibili relative alle caratteristiche dell’agente biologico e delle modalità lavorative che possono comportare un rischio di esposizione ad agenti biologici Valutazione del rischio 1. Il DL identifica le sorgenti di rischio presenti all’interno della realtà lavorativa in relazione alle specifiche attività Impianti distribuzione acqua o trattamento aria, apparecchiature che generano aerosol infettanti Temp. acqua (20°- 50°C), biofilm, acqua stagnante, sporcizia, incrostazioni, etc. 2. Individua i fattori di rischio ambientali 3. Applica i principi di buona prassi microbiologica e adotta misure preventive e protettive per ridurre il rischio di esposizione ad agenti biologici DLg. 81/08, Leggi Regionali, LG, Norme tecniche ACQUA POLVERE 4. Stima dell’entità dei rischi residui BIOAEROSOL LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI Monitoraggio microbiologico ambientale

1. IDENTIFICARE SORGENTI DI RISCHIO AB IMPIANTI TRATTAMENTO ARIA aerosol con legionella Condensatori evaporativi Serrande di presa dell’aria primaria UTA Filtri Batterie scambio termico Condotta aeraulica Vasca acqua condensa batterie Sezione umidificazione LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI

1. IDENTIFICARE SORGENTI DI RISCHIO AB IMPIANTI DISTRIBUZIONE ACQUA Acqua contaminata e impianti/attrezzature in grado di generare aerosol infettanti • impianti idrici (rubinetti, soffioni docce) • impianti di trattamento aria (torri di raffreddamento, sistemi di condizionamento, umidificatori etc. ) • piscine o sorgenti termali/ vasche idromassaggio • fontane decorative / sprinkler, etc. Operatori settore odontoiatrico Addetti alle operazioni di pulizia e manutenzione delle torri evaporative Addetti alla pulizia di autoveicoli Addetti alla manutenzione delle reti fognarie LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI

2. FATTORI DI RISCHIO AMBIENTALI LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI 10

2. FATTORI DI RISCHIO AMBIENTALI Cryptococcus neoformans (2°gruppo di rischio) è un lievito che causa un’infezione primaria a livello polmonare (forma asintomatica difficilmente diagnosticabile; meningoencefaliti nei pazienti immunocompromessi). LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI 11

2. FATTORI DI RISCHIO AMBIENTALI Biofilm Acqua stagnante Anomalie Installazione o inadempienze manutenzione impianti Sporcizia LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI 12

3. MISURE PREVENTIVE E PROTETTIVE PER RIDURRE IL RISCHIO ESPOSIZIONE AB LINEE GUIDA PER LA TUTELA E LA PROMOZIONE DELLA SALUTE NEGLI AMBIENTI CONFINATI (Supp. ordinario G. U. Serie generale n. 276 del 27 Novembre 2001) 27 Settembre 2001: Accordo tra il Ministro della Salute, le regioni e le province autonome sul documento concernente: “Linee guida per la tutela e la promozione della salute negli ambienti confinati”. o Situazioni di rischio per la salute riconducibili all’inquinamento degli ambienti indoor. o Indicazioni concernenti una serie di azioni per la gestione ed il controllo di tali rischi. o Le azioni proposte seguono i due indirizzi strategici della prevenzione primaria: -interventi di tipo tecnico-normativo -interventi di tipo educativo e persuasivo che incidono sul comportamento e lo stile di vita dei cittadini. LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI 13

3. MISURE PREVENTIVE E PROTETTIVE PER RIDURRE IL RISCHIO ESPOSIZIONE AB WHO GUIDELINES FOR INDOOR AIR QUALITY: DAMPNESS AND MOULD - 2009 Linee guida per la prevenzione ed il controllo della legionellosi (13. 05. 2015) http: //www. salute. gov. it/portale/documentazione/p 6_2_2_1. jsp? id=2362 LEGIONELLA AND THE PREVENTION OF LEGIONELLOSIS- World Health Organization 2007 LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI

3. MISURE PREVENTIVE E PROTETTIVE PER RIDURRE IL RISCHIO ESPOSIZIONE AB ACCORDO 7 FEBBRAIO 2013 PROCEDURA OPERATIVA PER LA VALUTAZIONE E GESTIONE DEI RISCHI CORRELATI ALL’IGIENE DEGLI IMPIANTI DI TRATTAMENTO ARIA Accordo in Conferenza Stato-Regioni del 7 febbraio 2013 Nella seduta del 7 febbraio 2013 la Conferenza permanente per i rapporti tra lo Stato, le Regioni e le province autonome di Trento e di Bolzano ha sancito l’accordo recante: «Procedura operativa per la valutazione e gestione dei rischi correlati all’igiene degli impianti di trattamento aria» realizzato dal sottogruppo Agenti Biologici del Comitato 9 della Commissione Consultiva Permanente per la Salute e la Sicurezza sul Lavoro. http: //www. lavoro. gov. it/Lavoro/Sicurezza. Lavoro/Primo. Piano/20130213_Accordo_Conferenza_Stato_Regioni. htm LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI

3. MISURE PREVENTIVE E PROTETTIVE PER RIDURRE IL RISCHIO ESPOSIZIONE AB Linee guida per la prevenzione ed il controllo della legionellosi (13. 05. 2015) http: //www. salute. gov. it/portale/documentazione/p 6_2_2_1. jsp? id=2362 Linee Guida Regionali • Regione Puglia: "Indirizzi Operativi per la sorveglianza clinica e ambientale della legionellosi nelle strutture sanitarie ed assistenziali della Regione Puglia" - Bollettino Ufficiale della Regione Puglia n. 114 del 31 agosto 2018 • Approvazione linee guida regionali per la sorveglianza e il controllo della legionellosi - Bollettino Ufficiale della Regione Emilia-Romagna - N. 167 del 19 -6 -2017 • Regione Toscana: Delibera della Giunta regionale N. 1009 del 26 ottobre 2015. Recepimento dell'Accordo di conferenza Stato-Regioni sul documento recante: "Linee guida per la prevenzione e il controllo della Legionellosi". • Regione Veneto: DELIBERAZIONE DELLA GIUNTA REGIONALE n. 1250 del 28 settembre 2015. Recepimento dell'Intesa tra il Governo, le Regioni e le Province autonome di Trento e Bolzano del 7 maggio 2015 sul documento recante "Linee guida per la prevenzione e il controllo della Legionellosi" - Bollettino Ufficiale della Regione Veneto n. 98 del 16 ottobre 2015 • Regione Sicilia: Decreto 5 agosto 2015 - Recepimento dell’Accordo tra il Governo, le Regioni e le Province autonome di Trento e di Bolzano sul documento recante “Linee guida per la prevenzione e il controllo della Legionellosi” Suppl. ord. alla GAZZETTA UFFICIALE DELLA REGIONE SICILIANA (p. I) n. 35 del 28 -8 -2015 (n. 32) • Regione Calabria: Linee Guida per la prevenzione ed il controllo della Legionellosi: recepimento Accordo Stato. Regioni Rep. Atti n. 79/csr del 7/05/2015 - DCA n. 54 del 4 Giugno 2015 LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI

4. STIMA DELL’ENTITÀ DEI RISCHI RESIDUI PROGRAMMI DI MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO AMBIENTALE DIFFICOLTA’ TECNICO-OPERATIVE • Scelta di siti di campionamento «significativi» dell’impianto di distribuzione acqua, trattamento aria, etc. • Quali matrici ambientali? Norme tecniche? • Quali metodologie di campionamento ed analisi? • Quali microrganismi? BIOAEROSOL • Come interpretare i risultati? ACQUA POLVERE Priorities for occupational safety and health research in Europe: 2013 -2020 …In order to be able to develop suitable risk management strategies, a further development of detection and identification methods for biological agents is needed to cover the whole spectrum of micro-organisms. …Direct measuring techniques allowing for quick decisions are needed, and it is particularly important to develop and validate protective measures. LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI

STRATEGIE DI CAMPIONAMENTO ED ANALISI CAMPIONAMENTO AMBIENTALE BIOAEROSOL CAMPIONAMENTO PERSONALE Selettori di particelle frazione inalabile (taglio 100 µ) Metodo di campionamento che permette di rilevare presenza di un particolare organismo o gruppo di microrganismi; Combinare l’uso di diversi campionatori per la determinazione di un vasto spettro di microrganismi aerodispersi LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI

VALUTAZIONE QUALITATIVA BIOAEROSOL: componente vitale e non vitale di particelle aerodisperse di origine biologica (microrganismi, frammenti, componenti o prodotti, etc) BIOAEROSOL Frazione vitale (metabolicamente attiva in grado di riprodursi) COLTIVABILE Frazione non vitale (cellule morte, componenti o prodotti di rilascio del microrganismo ) NON COLTIVABILE Terreni coltura ALLERGENI - ENDOTOSSINE MICOTOSSINE - MVOCs (PCR-q. PCR) LAL TEST BIOLOG system Identificazione biochimica ANALISI IMMUNOENZIMATICA ALLERGENI

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI BIOAEROSOL VALUTAZIONE QUANTITATIVA Per gli Agenti Biologici non sono disponibili valori limite di esposizione utilizzabili come valori limite soglia (Threshold Limit Values, TLVs ), in quanto le risposte dell’uomo variano da effetti innocui a gravi malattie e dipendono dal tipo di agente biologico e dalla suscettibilità individuale. Inoltre non sono disponibili dati riguardanti il rapporto dose-risposta (microrganismo-ospite). Esclusivamente per gli AB classificati nel 1° GRUPPO DI RISCHIO, per esprimere un giudizio relativamente all’entità della contaminazione, i valori delle concentrazioni microbiche aerodisperse sono stati confrontati con gli standard di qualità dell’aria “indoor” proposti dalla Commissione delle Comunità Europee (European Collaborative Action, Report n. 12, EUR 14988 EN 1993) LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI

European Collaborative Action, Indoor Air Quality & Its Impact on Man. Report No. 12. Biological Particles in Indoor Environments, Commission of the European Communities EUR 14988: 1993 LIVELLO* FUNGHI (UFC/m 3) Abitazioni LIVELLO* BATTERI (UFC/m 3) Abitazioni Molto basso < 100 Ambienti lavorativi non industriali < 50 Molto basso < 50 Ambienti lavorativi non industriali < 25 Basso < 200 < 100 Basso < 500 < 100 Medio < 1. 000 < 500 Medio < 2. 500 < 500 Alto < 10. 000 < 2. 000 Molto alto > 10. 000 > 2. 000 Gli attuali criteri interpretativi dei risultati relativi alla concentrazione del bioaerosol si *Gli intervalli di concentrazione riportati si basano su studi pubblicati letteratura nei quali sono stati impiegati campionatori e non implicano basano sul confronto indoor/outdoor e insulla prevalenza di generi eattivi specie microbiche. alcun giudizio sul rischio per la salute.

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI BIOAEROSOL VALUTAZIONE QUANTITATIVA L’EVENTUALE RISCONTRO DI AGENTI PATOGENI* COMPORTA SEMPRE LA MESSA IN ATTO DI INTERVENTI FINALIZZATI AL RIPRISTINO DI CONDIZIONI IGIENICHE ACCETTABILI A TUTELA DELLA SALUTE DEL LAVORATORE. * 2, 3 e 4 gruppo di rischio Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Aspergillus fumigatus Cryptococcus neoformans Legionella pneumophila LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI

VALUTAZIONE QUANTITATIVA INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI ENDOTOSSINE BATTERICHE Valutazione dell’esposizione ad agenti biologici attraverso indicatori di contaminazione microbiologica ambientale quali endotossine, allergeni, e Microbial Volatile Organic Compounds (MVOCs) prodotti del metabolismo microbico, ecc. ). Alcune relazioni dose-risposta sono state saggiate sia in studi sperimentali che epidemiologici. Nordic expert group and Dutch DECOS (2011) stabilisce come concentrazione massima ammissibile di endotossina 90 EU/m 3

VALUTAZIONE QUANTITATIVA INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI INDOOR ALLERGENS Valori teorici soglia per la sensibilizzazione (2µg /gr polvere) e per l’insorgenza di attacchi acuti di asma (10µg /gr polvere). (International Workshop on Indoor Allergens and Asthma)

…Direct measuring techniques allowing for quick decisions are needed… EMA-q. PCR: UN METODO RAPIDO E SENSIBILE PER QUANTIFICARE IL RISCHIO LEGIONELLA ANCHE DOPO TRATTAMENTI DI DISINFEZIONE La PCR quantitativa (q. PCR) è utilizzata da tempo per la stima di Legionella spp. nei campioni ambientali, ma non distingue tra cellule microbiche vitali e non vitali. ACQUA Alcune cellule di Legionella sono presenti nell’ambiente in uno stato vitale ma non coltivabile (Viable But Non-Culturable): -sono VIVE, ma hanno bassi livelli di attività metabolica -non crescono sui terreni di coltura comunemente usati per il loro isolamento In questo stato le cellule conservano la loro patogenicità (Alleron L et al. 2008, Dusserre E et al. 2008) diventando nuovamente infettanti quando cambiano le condizioni ambientali. Utilizzo del solo metodo colturale per la ricerca e quantificazione di Legionella spp. SOTTOSTIMA DEL RISCHIO INFETTIVO

viable PCR (v. PCR) Tecnica molecolare per rilevare la presenza di cellule vitali (coltivabili e non) (Nogva et al. 2003 “EMA-q. PCR” e in seguito da Nocker et al. 2006 “PMA-q. PCR”). EMA (Bromuro di Etidio Monoazide) entra selettivamente nelle cellule con membrana danneggiata (cellule morte) intercalandosi al DNA. In presenza di forte luce visibile (LED o lampada alogena) il gruppo azide dell’EMA viene convertito in un radicale nitrene altamente reattivo. Questa molecola si lega al DNA impedendone l’amplificazione durante la q. PCR. Viene amplificato solo il DNA delle cellule vitali Modified DNA non-amplifiable by q. PCR EMA + DNA Photoactivation DNA amplification in viable cell LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI EMA-q. PCR

RISULTATI In 158 campioni esaminati, la sensibilità e la specificità dell’EMA-q. PCR rispetto al gold standard erano pari rispettivamente al 100% e 84% (VPP=78% e VPN=100%) mentre quelle della q. PCR 100% e 47% (VPP=52% e VPN=100%). I risultati ottenuti con EMA-q. PCR correlavano con quelli del gold standard sia nel caso di acque non trattate che nel caso di quelle trattate al calore (r=0. 93) o con cloro (monoclorammina e biossido di cloro, r=0. 98) L’EMA-q. PCR può essere utilizzata per monitorare la qualità delle acque sottoposte a calore o a procedure di disinfezione con composti a base di cloro con il vantaggio di essere più rapida della coltura L’affiancamento di questa tecnica molecolare al metodo colturale contribuisce ad accrescere le nostre conoscenze circa il reale rischio di esposizione a Legionella spp. , permettendo anche di valutare in modo più accurato l’efficacia delle misure di controllo adottate.

LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI

CONCLUSIONI Le conoscenze riguardo gli effetti sulla salute causati da AB sono ancora per lo più limitate e frammentarie per la difficoltà di realizzazione delle indagini igienico ambientali : -assenza di procedure standardizzate di campionamento ed analisi -difficoltà di interpretazione dei dati quantitativi (microrganismi, loro componenti e/o prodotti) in assenza di valori di riferimento (benchmark) Attraverso la definizione di procedure uniformi di campionamento ed analisi potrebbero essere raccolti numerosi dati tra loro confrontabili da cui trarre evidenze scientifiche (relazioni dose-effetto) ed eventualmente valori limite di riferimento L`efficacia della prevenzione può quindi dipendere in modo cruciale dal tempo che intercorre tra il campionamento e la disponibilità di un dato analitico. LA RICERCA INAIL SULLA VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AD AGENTI BIOLOGICI

a. mansi@inail. it