Protein Analiz Yntemleri ve Proteomik Proteinler hcredeki tm

Protein Analiz Yöntemleri ve Proteomik

• Proteinler hücredeki tüm süreçlerde işlevseldir. • 22 farklı amino asitten oluşurlar ve böylece hücreler, dokular ve bireyler arasında çeşitliliği sağlarlar.

DNA m. RNA Protein Genom Transkriptom Proteom • Hücrenin yaşamını sürdürebilmesi için sahip olduğu DNA bilgisini protein ürününe dönüştürmesi gerekir. • Proteom: Organizmanın tüm protein içeriğidir. Çevresel koşullardan etkilenir ve değişkenlik gösterir.

Protein Karışımı Ayırım 2 D-PAGE Proteinler MALDI-TOF Spot Kesimi Peptitler Tripsin ile muamele Peptit kütle parmakizi Veritabanı Araştırmaları ESI-MS/MS Tandem MS Spektrumu Proteinlerin Tanımlanması ve post translasyonal modifikasyonlar 2 D-Jel Temelli Yaklaşım Kesim Protein karışımı Peptit Karışımı Ayırım Peptitler MS-MS μHPLC, 2 D-LC, Affinite. Kromatografisi Ayırım 2 D- HPLC Peptit fraksiyonları Protein Tripsin uygulaması fraksiyonları Jel Temelli Olmayan Yaklaşım LC-MS/MS Veritabanı araştırmaları Tandem MS spektrum Proteinlerin Tanımlanması

2 D Gel Software

Protein analizi için kullanılan yöntemler: • Elektroforez • Kromatografi • Protein parmakizi • ELISA “Enzyme-linked immunosorbent assay” • X-Işını Kristalografisi • Nüklear Manyetik Rezonans (NMR) • Kütle spektrometresi (Mass spectrometry, MS) • Protein mikroarray

Kromatografik Yöntemler İnce Tabaka Kromatografisi • Proteinlerin çözünme yeteneklerine göre ayrışım yapılır. • Katı bir yüzeye (selüloz) emdirilen örnek çözücü yüzey içine yerleştirilir. Çözücü solüsyonun yüzeyde ilerlemesiyle, örnekteki proteinler çözünme yeteneklerine göre ayrılırlar.

Kolon Kromatografisi • Porlu katı bir yüzeyden geçirilen proteinler, yüzeyle olan etkileşimlerine göre ayrılırlar. – İyon değişim kromatografisi: Proteinlerin iyonik yüklerine göre – Afinite kromatografisi: Proteinlerin kimyasal gruplara bağlanma özelliklerine göre – Jel filtrasyon kromatografisi: Proteinlerin büyüklüklerine göre

Kolon kromatografisi çeşitleri

Yüksek Basınç Sıvı Kromatografisi (HPLC) Proteinlere çok daha kuvvetli bağlanan yüzeye yüksek basınç uygulanarak proteinlerin yüzeyden çok daha hızlı geçmesi sağlanır.

Yüksek Basınç Sıvı Kromatografisi (HPLC) • HPLC’nin en önemli üstünlüğü ayırma gücü, duyarlılığı ve geri kazanımın yüksek, hızlı bir yöntem olmasıdır. Bu yöntemde hareketli faz 10 -400 atm. basınç altında kolondan 0. 1 -5 cm/s gibi yüksek bir hızla geçirilir. Bunun sonucu ayırma hızı çok daha düşük olan ve hidrostatik basınçla çalışan açık sıvı kolon kromotografisine göre çok daha yüksek olur. Böylece günler süren bir ayırma işlemi HPLC’de birkaç saatte tamamlanabilir. Bu yöntem saflaştırmanın yanı sıra protein çözeltilerinin tuzunu gidermek amacıyla da kullanılabilir.

Protein Parmakizi Yöntemi • Protein yapısı bozularak çeşitli boylarda peptidler oluşturulur (Tripsin + siyanojen bromür). • Jel elektroforezi veya kromatografik yöntemlerle protein parmakizi çıkarılır.

ELISA Yöntemi • “ELISA plate” antikor ile kaplanır. Antijen miktarı belirlenecek olan örnek kuyulara yüklenir. Antijen ile antikorun bağlanması beklenir. • Bağlanmamış veya özgün olmayan proteinler yıkama ile uzaklaştırılır. • Enzim bağlı ikincil antikorlar eklenir ve bunlarda antijen-antikor yapısına bağlanır (sandviç yapısı). • Enzimle etkileşecek substrat eklenerek oluşan ışıma ile protein miktarı spektrofotometrik olarak ölçülür.

X-Işını Kristalografisi (proteinlerin üç boyutlu yapısını araştırmada kullanılır) • X-ışınlarının dalga boyları küçük olduğundan moleküllerdeki atomlar arası boşlukları araştırmada kullanılabilir. • Bir solüsyon içinde hazırlanan kristaller aynı maddenin düzenli tekrarıyla oluşurlar. Kristallere gönderilen X-ışını kırınımlarının filme yansımasıyla pek çok molekülün yapısı tayin edilebilir. • Filme yansıyan noktaların şekli kristal içindeki molekül yapısını gösterir.

Maurice Wilkins ve Rosalind Franklin tarafından incelenen DNA X-ışını Kristalografisi ve DNA modeli

X-Işını Kristalografisi • Buna göre proteinin içerebileceği α sarmal ve β tabaka motifleri belirlenebilir. • Protein içi kimyasal bağlar hakkında bilgi edinilebilir. • Tüm verilerin toplanmasıyla proteinin üç boyutlu yapısı anlaşılabilir. • Bazı proteinlerin kristalize olmaması bu yöntemin kullanımını kısıtlar.

NMR Spektroskopisi (proteinlerin üç boyutlu yapısını araştırmada kullanılır) • NMR için yüksek saflıkta protein örneği kullanılır. • Doğal veya rekombinant proteinler için uygulanabilir. • Küçük proteinlerin (35 k. Da) yapı analizi için uygundur. NMR örnek tüpü

Yüksek manyetik alana (800 MHz) sahip bir NMR spektrometresi

NMR Spektroskopisi • Elektromanyetik bir alana konulan yüklü bir çekirdek α (düşük enerjili pozisyon) ve β olmak üzere iki şekilde hareket edebilir. • NMR spektrometresi çekirdeğin α dönüşünden β dönüşüne (düşük enerji seviyesinden yüksek enerji seviyesine ) geçmesi için gereken elektromanyetik radyasyonun frekansını ölçer. • Bu değer kullanılan çekirdek tipine (1 H, 13 C, 15 N) göre değişir. • Deney sonucunda alınan değer ile teoride olması gereken değer arasında fark vardır ve bu fark bize çekirdeğin çevresindeki elektron yoğunluğu hakkında bilgi verir. • Böylece çekirdeğin ilişkide olduğu veya çevresindeki atomlar belirlenebilir.

Dengedeki Örnek uyarılma gevşeme Uyarılma durumu Gözlem Spektrum

NMR Spektroskopisi • Kimyasal olarak indüklenmiş dinamik nuklear polarizasyon (CIDNP): Proteinlerin gerçek zamanlı katlanmalarıyla yapılarındaki değişimleri takip etmeyi sağlayan bir NMR yöntemidir.

Olumlu ve Olumsuz Yönleri • NMR kristal oluşumu gerektirmediği için kimi durumlarda üstünlük sağlayabilir. Ancak büyük proteinlerde NMR yöntemi verimli sonuç vermez. • Büyük moleküllerin NMR spektroskopisinde piklerin çakışması sorunu isotopik etiketleme ve çok boyutlu deneyler ile aşılmıştır. • Büyük moleküllerin analizi ile ilgili diğer bir sorun ise mıknatıslanmanın daha hızlı gevşemesidir. • Pikler daha geniş, güçsüz ve sonuçta görünmez olur. • Bu durum daha kısa sürede sinyal yakalanmasını gerektirir. • Bu gevşemeyi azaltmak için “Transverse relaxation optimized spektroscopy (TROSY)” yöntemi geliştirilmiştir.

Kütle Spektrometresi (MS) • Kütle spektrometresi “Mass spectrometry” MS, bir örnekteki iyonik maddeleri kütle farklılıklarına göre ayrırır. • Kütle spektrometresi 3 kısımdan oluşur. • İyon kaynağı • Kütle analizörü • Detektör sistem

Kütle Spektrometresi (MS) • Aşamalar: – Örneklerden iyonların elde edilmesi – Farklı kütlelerdeki iyonların ayrışımı – Kütle spektrumunun oluşması için verilerin biriktirilmesi

Protein analizinde “top-down” stratejisi: • Kütle spektrometresinde proteinlerin iyonizasyonu için kullanılan iki yöntem vardır. – Elektrospray iyonizasyonu (ESI) – “Matrix-assisted laser desorption/ionization” (MALDI) • Proteinler öncelikle bu yöntemlerden biriyle iyonize edilir ve daha sonra bir kütle analizörüne girer.

MALDI-To. F Timed ion selector Laser Sample plate Accelerating field + + Reflector + + + Flight tube Detectors

Protein analizinde “bottom-up” stratejisi: • Proteinler elektroforetik ayrışımdan sonra enzimatik olarak kesilir (tripsin veya pepsin) ve daha küçük peptidler oluşur. • Biriken peptid ürünleri daha sonra kütle analizörüne girer. • Bu yönteme peptid kütle parmakizi (PMF) denir.

Kütle Spektrometresi (MS) • “Time-of-flight” (TOF) analizöründe iyonları hızlandırmak için elektrik alan kullanılır ve sonra iyonların dedektöre ulaşmasıyla ölçüm alınır. • İyonların dedektörde toplanma süreleri (“Time-offlight”) iyonik yükleri ile doğru; molekül ağırlıkları ile ters orantılıdır. Yani daha hafif iyonlar dedektöre daha hızlı ulaşır.

Protein Mikroarray • Protein moleküllerinin, belli bir düzende cam bir yüzeye bağlanmalarıyla oluşturulur. • Kullanım alanları – – proteinlerin varlığının ve miktarının belirlenmesi protein-protein etkileşimi protein-nükleik asit etkileşimi enzimlerin substratlarının bulunması