Molekulrn diagnostika mikroorganism Molekulrn diagnostika salmonel Modern metody
- Slides: 51
Molekulární diagnostika mikroorganismů Molekulární diagnostika salmonel. Moderní metody sekvenování DNA Ivan Rychlík Výzkumný ústav veterinárního lékařství v. v. i. Brno
ČSN EN ISO 6579 Mikrobiologie potravin a krmiv Horizontální metoda průkazu bakterií rodu Salmonella Předpomnožení v neselektivní tekuté půdě Pomnožení v selektivních tekutých půdách Vyočkování a identifikace Konfirmace Další typizace
Předpomnožení v neselektivní tekuté půdě Pufrovaná (tlumivá) peptonová voda Buffered peptone water 25 g vzorku do 225 ml půdy 16 - 20 hod při 37 C
Pomnožení v selektivních tekutých půdách Půda podle Rappaporta a Vassiliadise (pro průkaz bakterií rodu Salmonella v trusu zvířat a vzorcích z prostředí prvovýroby může být semisolidní) Inokulace 0, 1 ml z předpomnožovací půdy do 10 ml RV půdy inkubace při 41, 5 °C po dobu 24 h (dle potřeby i dalších 24 h) Inhibiční efekt vysoké koncentrace Mg. Cl 2 a malachitové zeleně Půda podle Mullera a Kaufmanna s tetrathionátem a novobiocinem inkubace při 37 °C po dobu 24 h (dle potřeby i dalších 24 h) Inhibiční efekt briliant zeleně, jódu a jodidu draselného, žlučových kyselin, thiosíranu sodného a novobiocinu
Vyočkování a identifikace Z pomnožovací půdy se kličkou vyočkuje na 1. xyloso-lysin-deoxycholátový agar (XLD) 2. jakoukoliv selektivní půdu určená pro stanovení salmonel tedy např. Briliant Green Agar (BGA) Rambach agar IRIS Salmonella agar Triple Sugar Iron agar (TSI agar, s glukózou, laktózou, sacharózou a citranem železitým) Agar s močovinou Půda k otestování dekarboxylace L-lyzinu
Xyloso-lysin-deoxycholátový agar (XLD) Xylóza, laktóza, sacharóza L-lysine thiosíran sodný citronan železitý fenolová červeň – pouze indikátor Sodium desoxycholate – potlačuje růst G+ Salmonella využívá thiosíran a metabolizuje jej na H 2 S. Vzniklý sirovodík pak reaguje s citronanem za vzniku černého precipitátu Fe. S. Salmonella sice fermentuje xylózu, ale ne zbývající dva cukry. Salmonella současně dekarboxyluje lysin za vzniku bazického kadaverinu. Ten neutralizuje kyselé p. H vzniklé fermentací xylózy. E. coli však fermentuje i laktózu a dekarboxylace lyzinu nestačí neutralizovat p. H. To se projeví změnou barvy fenolové červeně do žluté.
Brilliant Green Agar Laktóza, sacharóza – nejsou fermentovány salmonelami fenolová červeň jako indikátor p. H briliant zeleň Salmonella roste jako červená nebo růžová kolonie Laktóza nebo sacharóza fermentující baktérie rostou jako drobné žluté kolonie
Rambach agar Propylene glycol -> acids (pouze Salmonella) neutral červeň v kyselém prostředí precipituje Salmonella proto roste jako výrazně červená X-Gal, proto Lac pozitivní E. coli rostou modře deoxycholát na potlačení růstu Gram pozitivních
Konfirmace Nejméně 5 kolonií ze selektivních agarů se subkultivuje na živný agar k další testaci pomocí biochemických a sérologických testů Triple Sugar Iron agar (TSI agar, s glukózou, laktózou, sacharózou a citranem železitým) Agar s močovinou Půda k otestování dekarboxylace L-lyzinu Pestrá řada cukrů slouží ke sledování schopnosti mikroorganismů využívat různé druhy cukrů. Testy jsou prováděny v tekuté půdě s přídavkem 0, 5 -1 % substrátu. Nejčastěji se testuje schopnost utilizovat glukózu, laktózu, sacharózu, ribózu, atd. K detekci se používá acidobazický indikátor (např. bromthymolová modř, bromkrezolový purpur, fenolová červeň). V pozitivním případě dochází zkvašováním substrátu ke tvorbě organických kyselin, které okyselují médium a způsobí změnu indikátoru, tj. reakční směs změní barvu z původní zelené, resp. červené, na žlutou. Serologie PCR
Konfirmace - biochemie Enterotest API
Konfirmace - serologie
Serotypizace - O antigeny salmonel B (O-antigen)n Glc-Glc NAc Glc Glc-Gal Hep A D KDO-KDO
Serotypizace – H antigeny salmonel
Konfirmace - PCR cílové geny z ostrova patogenity SPI 1 = velmi specifické pro rod Salmonella hil. A, inv. A
Konfirmace – multiplex PCR
Další typizace a charakterizace - PFGE
Další typizace a charakterizace - rezistence k antibiotikům
Další typizace a charakterizace - analýza plazmidových profilů nízkomolekulární plazmidy 2 - 10 kb chromozomální DNA plazmid virulence 55 kb
Další typizace a charakterizace - fágová typizace
Další typizace a charakterizace - motilita v semisolidním agaru
Další typizace a charakterizace - sekvenování
Sekvenování nukleových kyselin Maxam a Gilbert, částečná degradace NK Sanger, dideoxy terminátory Next. Gen sekvenování
NTP, dd. NTP
Sekvenování DNA s využitím dd. NTPs dd. ATP
Sekvenování DNA s využitím dd. NTPs : dd. ATP
Sekvenování DNA s využitím dd. NTPs : dd. ATP : dd. CTP : dd. GTP : dd. TTP
Sekvenování DNA elektroforetická separace extenzních produktů převedení fluorescenčních signálů do výsledné sekvence Identifikace do 1 000 bp od primeru
Sekvenování vybraných genů Salmonella
Multi Locus Sequence Typing (MLST) Sequencing of house-keeping genes 199 gene fragments, approx. 500 bp each in S. Typhi Roumagnac et al. 2006 Evolutionary history of Salmonella Typhi. Science 314, 1301 -1304
Next generation sequencing (Next. Gen) Pyrosequencing GS Junior Generates approx. 100 000 reads, each 400 bp of average length
Next. Gen sekvenování DNA pyrosekvenování až 100 000 sekvencí, 400 bp na sekvenci
Next. Gen sekvenování DNA pyrosekvenování
Next. Gen sekvenování DNA pyrosekvenování
Next. Gen sekvenování DNA Sekvenování genómů živých organismů, zejména baktérií Cena okolo 100 Euro za sekvenaci jednoho bakteriálního genomu
Další využití pyrosekvenování Se zařazením PCR sekvenování 16 S r. RNA genů sekvenování variabilních částí imunoglobulinů sekvenování genovýc kazet v integronech
Charakterizace střevní mikroflóry Sekvenování genů pro 16 S r. RNA
PCR amplifikace genů pro 16 S r. RNA, DNA z obsahu slepého střeva
Development of caecal microbiota in Gallus gallus 100 80 Desulfovibrionaceae Acidaminococcaceae Lactobacillaceae 70 Ruminococcaceae 60 Lachnospiraceae % of total microbiota 90 50 Prevotellaceae Rikenellaceae 40 Porphyromonadaceae 30 20 Bacteroidaceae 10 0 Bifidobacteriaceae 0 10 20 30 40 age of poultry (weeks) 50 60
Correlation among bacterial genera themselves, prediction of bacterial mutualism or competitive exclusion
Pyrosequencing of variable regions of Ig transcripts
Ig in the spleen of non-infected chickens Ig in the spleen of Salmonellainfected chickens
Struktura integronu • 5´CS - int I + att I • centrální variabilní region • 3´CS - sul 1 int 1 sul 1 orf int 1 sul 1
Další využití pyrosekvenování Bez mezikroku PCR shotgun sekvenování DNA sekvenování RNA/c. DNA
Shotgun sekvenování DNA Sekvenování vzorků střevní mikroflóry, atypické ekologické niky - metabolic potential viry u zvířat bez klinických příznaků fágy ve střevním traktu genom a mikrobiom mamuta absence jakéhokoli zkreslení výsledků náročné na zpracování
RNA/c. DNA sequencing Gross pathology in the spleen after intravenous with S. Enteritidis
Intravenózní infekce slepic Salmonella Enteritidis odběr vzorků 4 DPI Izolace RNA z celkové sleziny Reverzní transkripce 454 pyrosekvenování verifikace pomocí RT PCR
% of total gene expression Gene expression in the noninfected chickens fabp 1 adh 1 B LOC 769608 hpgd RALDH 1 calb 1 sult 1 C 3 aqp 8 Ig. A Ig. G Day of life
% of total gene expression Gene expression in the noninfected chickens fabp 1 adh 1 B LOC 769608 hpgd RALDH 1 calb 1 sult 1 C 3 aqp 8 Ig. A Ig. G Gene expression in the infected chickens % of total gene expression Day of life rsfr mmp 7 SAA ptgs AH 221 ES 1 Ex. FABP AVD Day of life Ig. A Ig. G
- Diagnostika kresby
- Metody pedagogickej diagnostiky
- Diagnostika staveb
- Kresba postavy proporce
- Pozorovací arch diagnostika
- Diagnostika potaov hp
- Pristroj eri
- Diagnostika potaov toshiba
- Diagnostika rodiny
- Kostochondritida
- Sindelarova diagnostika
- Tukša augļa ola simptomi
- Osobná diagnostika
- Osteoporozes diagnostika
- Oregonská metoda
- Diagnostika školní zralosti a připravenosti
- Diagnostika kresby
- Pedagogická diagnostika vzor
- Spektrofotometr schemat
- Metody dyscyplinowania uczniów
- Metody oceny stanu zdrowia pacjenta
- Metody szacowania ryzyka
- Metody pomiaru bezrobocia
- Serologicke metody
- Metody pomiaru temperatury
- Metody zarządzania ryzykiem walutowym w przedsiębiorstwie
- Metody dyscyplinowania uczniów
- Jaké metody používáme k odchytu vodních živočichů
- Turbidymetria i nefelometria
- Metoda biuretowa oznaczania białek
- Metody vývojové psychologie
- Sformuować
- Uniwersytet rzeszowski wydział wychowania fizycznego
- Metody utrwalania żywności
- Janusz korczak przyjaciel dzieci
- Metody historyczne
- Metody, techniki i narzędzia badawcze
- Metody jakościowe
- Metody utrwalania żywności
- Metody aktywizujące przykłady
- Metody sieciowe
- Metody aktywizujące przykłady
- Metody doboru pracowników
- Metody kinezioterapie
- Gerydon kelnerski
- Czujnik magnetosprężysty
- Planowanie zatrudnienia
- Autyzm prezentacja
- Podział metod nauczania
- Metody numeryczne
- Dywanik pomysłów - metoda aktywizująca
- Metody aktywizujące przykłady