Molekulrn diagnostika mikroorganism Molekulrn diagnostika salmonel Modern metody

  • Slides: 51
Download presentation
Molekulární diagnostika mikroorganismů Molekulární diagnostika salmonel. Moderní metody sekvenování DNA Ivan Rychlík Výzkumný ústav

Molekulární diagnostika mikroorganismů Molekulární diagnostika salmonel. Moderní metody sekvenování DNA Ivan Rychlík Výzkumný ústav veterinárního lékařství v. v. i. Brno

ČSN EN ISO 6579 Mikrobiologie potravin a krmiv Horizontální metoda průkazu bakterií rodu Salmonella

ČSN EN ISO 6579 Mikrobiologie potravin a krmiv Horizontální metoda průkazu bakterií rodu Salmonella Předpomnožení v neselektivní tekuté půdě Pomnožení v selektivních tekutých půdách Vyočkování a identifikace Konfirmace Další typizace

Předpomnožení v neselektivní tekuté půdě Pufrovaná (tlumivá) peptonová voda Buffered peptone water 25 g

Předpomnožení v neselektivní tekuté půdě Pufrovaná (tlumivá) peptonová voda Buffered peptone water 25 g vzorku do 225 ml půdy 16 - 20 hod při 37 C

Pomnožení v selektivních tekutých půdách Půda podle Rappaporta a Vassiliadise (pro průkaz bakterií rodu

Pomnožení v selektivních tekutých půdách Půda podle Rappaporta a Vassiliadise (pro průkaz bakterií rodu Salmonella v trusu zvířat a vzorcích z prostředí prvovýroby může být semisolidní) Inokulace 0, 1 ml z předpomnožovací půdy do 10 ml RV půdy inkubace při 41, 5 °C po dobu 24 h (dle potřeby i dalších 24 h) Inhibiční efekt vysoké koncentrace Mg. Cl 2 a malachitové zeleně Půda podle Mullera a Kaufmanna s tetrathionátem a novobiocinem inkubace při 37 °C po dobu 24 h (dle potřeby i dalších 24 h) Inhibiční efekt briliant zeleně, jódu a jodidu draselného, žlučových kyselin, thiosíranu sodného a novobiocinu

Vyočkování a identifikace Z pomnožovací půdy se kličkou vyočkuje na 1. xyloso-lysin-deoxycholátový agar (XLD)

Vyočkování a identifikace Z pomnožovací půdy se kličkou vyočkuje na 1. xyloso-lysin-deoxycholátový agar (XLD) 2. jakoukoliv selektivní půdu určená pro stanovení salmonel tedy např. Briliant Green Agar (BGA) Rambach agar IRIS Salmonella agar Triple Sugar Iron agar (TSI agar, s glukózou, laktózou, sacharózou a citranem železitým) Agar s močovinou Půda k otestování dekarboxylace L-lyzinu

Xyloso-lysin-deoxycholátový agar (XLD) Xylóza, laktóza, sacharóza L-lysine thiosíran sodný citronan železitý fenolová červeň –

Xyloso-lysin-deoxycholátový agar (XLD) Xylóza, laktóza, sacharóza L-lysine thiosíran sodný citronan železitý fenolová červeň – pouze indikátor Sodium desoxycholate – potlačuje růst G+ Salmonella využívá thiosíran a metabolizuje jej na H 2 S. Vzniklý sirovodík pak reaguje s citronanem za vzniku černého precipitátu Fe. S. Salmonella sice fermentuje xylózu, ale ne zbývající dva cukry. Salmonella současně dekarboxyluje lysin za vzniku bazického kadaverinu. Ten neutralizuje kyselé p. H vzniklé fermentací xylózy. E. coli však fermentuje i laktózu a dekarboxylace lyzinu nestačí neutralizovat p. H. To se projeví změnou barvy fenolové červeně do žluté.

Brilliant Green Agar Laktóza, sacharóza – nejsou fermentovány salmonelami fenolová červeň jako indikátor p.

Brilliant Green Agar Laktóza, sacharóza – nejsou fermentovány salmonelami fenolová červeň jako indikátor p. H briliant zeleň Salmonella roste jako červená nebo růžová kolonie Laktóza nebo sacharóza fermentující baktérie rostou jako drobné žluté kolonie

Rambach agar Propylene glycol -> acids (pouze Salmonella) neutral červeň v kyselém prostředí precipituje

Rambach agar Propylene glycol -> acids (pouze Salmonella) neutral červeň v kyselém prostředí precipituje Salmonella proto roste jako výrazně červená X-Gal, proto Lac pozitivní E. coli rostou modře deoxycholát na potlačení růstu Gram pozitivních

Konfirmace Nejméně 5 kolonií ze selektivních agarů se subkultivuje na živný agar k další

Konfirmace Nejméně 5 kolonií ze selektivních agarů se subkultivuje na živný agar k další testaci pomocí biochemických a sérologických testů Triple Sugar Iron agar (TSI agar, s glukózou, laktózou, sacharózou a citranem železitým) Agar s močovinou Půda k otestování dekarboxylace L-lyzinu Pestrá řada cukrů slouží ke sledování schopnosti mikroorganismů využívat různé druhy cukrů. Testy jsou prováděny v tekuté půdě s přídavkem 0, 5 -1 % substrátu. Nejčastěji se testuje schopnost utilizovat glukózu, laktózu, sacharózu, ribózu, atd. K detekci se používá acidobazický indikátor (např. bromthymolová modř, bromkrezolový purpur, fenolová červeň). V pozitivním případě dochází zkvašováním substrátu ke tvorbě organických kyselin, které okyselují médium a způsobí změnu indikátoru, tj. reakční směs změní barvu z původní zelené, resp. červené, na žlutou. Serologie PCR

Konfirmace - biochemie Enterotest API

Konfirmace - biochemie Enterotest API

Konfirmace - serologie

Konfirmace - serologie

Serotypizace - O antigeny salmonel B (O-antigen)n Glc-Glc NAc Glc Glc-Gal Hep A D

Serotypizace - O antigeny salmonel B (O-antigen)n Glc-Glc NAc Glc Glc-Gal Hep A D KDO-KDO

Serotypizace – H antigeny salmonel

Serotypizace – H antigeny salmonel

Konfirmace - PCR cílové geny z ostrova patogenity SPI 1 = velmi specifické pro

Konfirmace - PCR cílové geny z ostrova patogenity SPI 1 = velmi specifické pro rod Salmonella hil. A, inv. A

Konfirmace – multiplex PCR

Konfirmace – multiplex PCR

Další typizace a charakterizace - PFGE

Další typizace a charakterizace - PFGE

Další typizace a charakterizace - rezistence k antibiotikům

Další typizace a charakterizace - rezistence k antibiotikům

Další typizace a charakterizace - analýza plazmidových profilů nízkomolekulární plazmidy 2 - 10 kb

Další typizace a charakterizace - analýza plazmidových profilů nízkomolekulární plazmidy 2 - 10 kb chromozomální DNA plazmid virulence 55 kb

Další typizace a charakterizace - fágová typizace

Další typizace a charakterizace - fágová typizace

Další typizace a charakterizace - motilita v semisolidním agaru

Další typizace a charakterizace - motilita v semisolidním agaru

Další typizace a charakterizace - sekvenování

Další typizace a charakterizace - sekvenování

Sekvenování nukleových kyselin Maxam a Gilbert, částečná degradace NK Sanger, dideoxy terminátory Next. Gen

Sekvenování nukleových kyselin Maxam a Gilbert, částečná degradace NK Sanger, dideoxy terminátory Next. Gen sekvenování

NTP, dd. NTP

NTP, dd. NTP

Sekvenování DNA s využitím dd. NTPs dd. ATP

Sekvenování DNA s využitím dd. NTPs dd. ATP

Sekvenování DNA s využitím dd. NTPs : dd. ATP

Sekvenování DNA s využitím dd. NTPs : dd. ATP

Sekvenování DNA s využitím dd. NTPs : dd. ATP : dd. CTP : dd.

Sekvenování DNA s využitím dd. NTPs : dd. ATP : dd. CTP : dd. GTP : dd. TTP

Sekvenování DNA elektroforetická separace extenzních produktů převedení fluorescenčních signálů do výsledné sekvence Identifikace do

Sekvenování DNA elektroforetická separace extenzních produktů převedení fluorescenčních signálů do výsledné sekvence Identifikace do 1 000 bp od primeru

Sekvenování vybraných genů Salmonella

Sekvenování vybraných genů Salmonella

Multi Locus Sequence Typing (MLST) Sequencing of house-keeping genes 199 gene fragments, approx. 500

Multi Locus Sequence Typing (MLST) Sequencing of house-keeping genes 199 gene fragments, approx. 500 bp each in S. Typhi Roumagnac et al. 2006 Evolutionary history of Salmonella Typhi. Science 314, 1301 -1304

Next generation sequencing (Next. Gen) Pyrosequencing GS Junior Generates approx. 100 000 reads, each

Next generation sequencing (Next. Gen) Pyrosequencing GS Junior Generates approx. 100 000 reads, each 400 bp of average length

Next. Gen sekvenování DNA pyrosekvenování až 100 000 sekvencí, 400 bp na sekvenci

Next. Gen sekvenování DNA pyrosekvenování až 100 000 sekvencí, 400 bp na sekvenci

Next. Gen sekvenování DNA pyrosekvenování

Next. Gen sekvenování DNA pyrosekvenování

Next. Gen sekvenování DNA pyrosekvenování

Next. Gen sekvenování DNA pyrosekvenování

Next. Gen sekvenování DNA Sekvenování genómů živých organismů, zejména baktérií Cena okolo 100 Euro

Next. Gen sekvenování DNA Sekvenování genómů živých organismů, zejména baktérií Cena okolo 100 Euro za sekvenaci jednoho bakteriálního genomu

Další využití pyrosekvenování Se zařazením PCR sekvenování 16 S r. RNA genů sekvenování variabilních

Další využití pyrosekvenování Se zařazením PCR sekvenování 16 S r. RNA genů sekvenování variabilních částí imunoglobulinů sekvenování genovýc kazet v integronech

Charakterizace střevní mikroflóry Sekvenování genů pro 16 S r. RNA

Charakterizace střevní mikroflóry Sekvenování genů pro 16 S r. RNA

PCR amplifikace genů pro 16 S r. RNA, DNA z obsahu slepého střeva

PCR amplifikace genů pro 16 S r. RNA, DNA z obsahu slepého střeva

Development of caecal microbiota in Gallus gallus 100 80 Desulfovibrionaceae Acidaminococcaceae Lactobacillaceae 70 Ruminococcaceae

Development of caecal microbiota in Gallus gallus 100 80 Desulfovibrionaceae Acidaminococcaceae Lactobacillaceae 70 Ruminococcaceae 60 Lachnospiraceae % of total microbiota 90 50 Prevotellaceae Rikenellaceae 40 Porphyromonadaceae 30 20 Bacteroidaceae 10 0 Bifidobacteriaceae 0 10 20 30 40 age of poultry (weeks) 50 60

Correlation among bacterial genera themselves, prediction of bacterial mutualism or competitive exclusion

Correlation among bacterial genera themselves, prediction of bacterial mutualism or competitive exclusion

Pyrosequencing of variable regions of Ig transcripts

Pyrosequencing of variable regions of Ig transcripts

Ig in the spleen of non-infected chickens Ig in the spleen of Salmonellainfected chickens

Ig in the spleen of non-infected chickens Ig in the spleen of Salmonellainfected chickens

Struktura integronu • 5´CS - int I + att I • centrální variabilní region

Struktura integronu • 5´CS - int I + att I • centrální variabilní region • 3´CS - sul 1 int 1 sul 1 orf int 1 sul 1

Další využití pyrosekvenování Bez mezikroku PCR shotgun sekvenování DNA sekvenování RNA/c. DNA

Další využití pyrosekvenování Bez mezikroku PCR shotgun sekvenování DNA sekvenování RNA/c. DNA

Shotgun sekvenování DNA Sekvenování vzorků střevní mikroflóry, atypické ekologické niky - metabolic potential viry

Shotgun sekvenování DNA Sekvenování vzorků střevní mikroflóry, atypické ekologické niky - metabolic potential viry u zvířat bez klinických příznaků fágy ve střevním traktu genom a mikrobiom mamuta absence jakéhokoli zkreslení výsledků náročné na zpracování

RNA/c. DNA sequencing Gross pathology in the spleen after intravenous with S. Enteritidis

RNA/c. DNA sequencing Gross pathology in the spleen after intravenous with S. Enteritidis

Intravenózní infekce slepic Salmonella Enteritidis odběr vzorků 4 DPI Izolace RNA z celkové sleziny

Intravenózní infekce slepic Salmonella Enteritidis odběr vzorků 4 DPI Izolace RNA z celkové sleziny Reverzní transkripce 454 pyrosekvenování verifikace pomocí RT PCR

% of total gene expression Gene expression in the noninfected chickens fabp 1 adh

% of total gene expression Gene expression in the noninfected chickens fabp 1 adh 1 B LOC 769608 hpgd RALDH 1 calb 1 sult 1 C 3 aqp 8 Ig. A Ig. G Day of life

% of total gene expression Gene expression in the noninfected chickens fabp 1 adh

% of total gene expression Gene expression in the noninfected chickens fabp 1 adh 1 B LOC 769608 hpgd RALDH 1 calb 1 sult 1 C 3 aqp 8 Ig. A Ig. G Gene expression in the infected chickens % of total gene expression Day of life rsfr mmp 7 SAA ptgs AH 221 ES 1 Ex. FABP AVD Day of life Ig. A Ig. G