Metode analize uzoraka Doc dr Jelena Cveji Nataa

Metode analize uzoraka Doc. dr Jelena Cvejić Nataša Milošević

� U farmakokinetičkim ispitivanjima, bioanalitičkim metodama se ispituju i određuju lekovi i njihovi metaboliti u biološkom materijalu u cilju: � 1) određivanja farmakokinetičkih parametra; � 2) praćenja metabolizma lekova; � 3) praćenja – individualizacija terapije; � 4) korelacija koncentracije leka sa terapijskim efektom; � 5) kontrola stepena poštovanja uputstva lekara; � 6) određivanje biološke raspoloživosti i biološke ekvivalentnosti lekova; � 7) ispitivanja interakcija lekova pri kombinovanoj terapiji

Bioanalitičke metode analize I) Hromatografske metode � 1) Gasna hromatografija � 2) Visoko efikasna tečna hromatografija � 3) Hromatografija na tankom sloju II) Masena spektrometrija III) Imunohemijske metode IV) Druge metode

I) Hromatografske metode 1) Gasna hromatografija Princip: Supstance injicirane u gasni hromatograf isparavaju pri povišenoj temperaturi i bivaju preuzete i nošene inertnim gasom nosiocem preko velike površine neisparljive tečne (stacionarne) faze u kojoj se raspodeljuju. Efluenti koji se detektuju prolaze kroz detektor.

1)Gasna hromatografija � 1) Gas nosilac, koji mora biti inertan, obično je azot, helijum ili argon, a tragovi vode i vazduha se smatraju onečišćenjem. � 2) Injektor - metalna termostabilna cev u nezavisnom grejaču. � 3) Peć – sastoji se iz elemenata za zagrevanje, termostata i izolacije. �a) gradijentni proces �b) izotermijski proces

1) Gasna hromatografija � 4) Kolona – staklena cev napunjena čvrstim nosačem koji je prevučen tečnom fazom. Kao nosači se koriste polimeri polietilenglikola-polaran ili ugljovodonika dugog lanca sa niskim naponom pare. �Razdvajanje komponenti iz smeše vrši se raspodelom između tečne (stacionarne) i gasne (mobilne) faze. Retencija (zadržavanje) jedinjenja na koloni je funkcija njihovih fizičko-hemijskih interakcija s tečnom fazom, temperature i brzine proticanja gasne faze. � 5) Detektor – sistem za detekciju ispitivanih supstanci. �a) detektor termalne provodljivosti; �b) plameno-jonizacioni detektor � 6) Pojačivač � 7) Pisač – ispisuje nastale signale i dobija se odgovarajuči hromatogram.

2) Visoko efikasna tečna hromatografija - HPLC Princip: Supstance injicirane u tečni hromatogram pod visokim pritiskom se razdvajaju na koloni mehanizmom adsorbcije, raspodele, kombinovanim efektima ova dva mehanizma, jonskom izmenom ili mehanizmom jonskih parova. HPLC se koristi za: - identifikaciju - razdvajanje - prečišćavanje - odredjivanje sadržaja - osetljivost - preciznost - ponovljivost

2) Visoko efikasna tečna hromatografija - HPLC

2) Visoko efikasna tečna hromatografija - HPLC � 1) Rezervoar potrebnog rastvarača � 2) Pumpa � 3) Injektor � 4) Kolona – može biti od stakla ili nerđajućeg čelika. Zavisno od mehanizma razdvajanja koriste se odgvarajuće stacionarne i mobile faze. � Često se kao stacionarna faza u adsorbcionoj hromatografiji koristi silikagel, a mobilne faze zavise od polarnosti ispitivanih jedinjenja. U podeonoj hromatografiji se koristi i modifikovani silikagel pr. ODS (oktadecilsilikagel). � a) izokratska elucija � b) gradijentna elucija � 5) Detektor- najčešće UV detektori

2) Visoko efikasna tečna hromatografija - HPLC DETEKCIJA i ODREDJIVANJE SADRŽAJA LEKA I NJEGOVIH METABOLITA U BIOLOŠKIM TEČNOSTIMA I TKIVIMA

2) Visoko efikasna tečna hromatografija - HPLC EKSPERIMENTI IN VIVO dobrovoljci ogledne životinje registracija lekova pre-klinička ispitivanja naučna istraživanja

2) Visoko efikasna tečna hromatografija - HPLC Neophodna visoka preciznost tokom rada Radi obezbedjenja tačnosti odredjivanja korišćenje internog standarda/kontrola ekstrakcije Upotreba preciznih volumetrijskih sudova Merenje više serija ogleda

2) Visoko efikasna tečna hromatografija - HPLC METOPROLOL b-blokator, Kao tablete i injekcije u obliku tartarata, i kao tablete odloženog dejstva u obliku sukcinata mg doze (100 mg tableta metoprolol tartarat) Primer : osoba 75 kg, 75/13 = 5, 8 l krvi, ako je 100 % resorbovano c= 0, 02 mg/ml (20 mg/ml) Resorpcija, “first-pass” metabolizam u jetri, distribucija (jetra, srce, pluća, pljuvačka, krv), metabolizam. . .

Priprema uzorka � 50 ml antikoagulansa na 10 ml krvi �Centrifugiranje - odvajanje plazme od eritrocita �Direktna manipulacija plazme ili zamrzavanje 1 ml plazme + 200 ml TCA - precipitacija proteina - centrifugiranje Metoprolol (katjon) + baza (200 ml amonijaka) = nejonizovan oblik 2 ml hloroforma - prelaz u organski sloj Centrifugiranje, uparavanje, 50 ml Me. OH HPLC

HPLC analiza Kolona : ODS hypersyl Temperatura : 25°C Protok : 0, 5 ml/min Mobilna faza : Me. OH / THF / fosfatni pufer p. H 2, 7 (65 / 30) Injektovanje standarda - dirktno u Meo. H - iz “blank” uzorka plazme Injektovanje serije Ponovljeni standardi iz “blank” plazme

HROMATOGRAMI

3) Hromatografija na tankom sloju �Danas se posebno koristi visoko efikasna hromatografija na tankom sloju (HPTLC- High Performance Thin Layer Chromatography). �Za kvantitativnu analizu u onvakvim istraživanjima količine supstanci se mere direktno na pločama spektroskopskom metodom denzimetrijom.

II) Masena spektrometrija �Može se koristiti sama ili u kombinaciji sa drugim tehnikama kao npr. sa gasnom hromatografijom ili sa HPLC. �Zasnovana je na stvaranju i razdvajanju jonizovanih molekula ili jonizovanih fragmenata molekula leka u vakuumu. Za identifikovanje ispitivanih jedinjenja ovom metodom najvažnije je dobiti molekulski jon (M+) tj. jonizovani molekul jedinjenja.

II) Masena spektrometrija

II) Masena spektrometrija

II) Masena spektrometrija � Tehnika Electron Impact MS (tehnika elektronskog udara) omogućuje potpunu fragmentaciju molekula, a ako je fragmentacija nemoguća na osnovu dobijenih fragmenata primenjuju se metode se hemijske jonizacije. (Chemical Ionization MS)

III) Imunohemijske metode �Princip: �Afinitet specifičnih antitela prema molekulima antigena, čiji su delovi imunogene determinante antitela. �Potrebna su At sposobna da vezuju lek koji se ispituje. Lekovi su male M (manje od 1000), nisu Ag, pa je potrebno da se konjuguju kovalentno, kao hapten sa antigenim proteinom pre imunizacije.

III) Imunohemijske metode � 1) Radio-imunohemijske metode (RIARadio. Immuno. Assays), gde je Ag obeležen odgovarajućim radioizotopom, a meri se broj radioaktivnih raspada. � 2) Enzimsko-imunohemijske metode (Enzyme. Immuno. Assays-EIA), gde su Ag, hapten ili antitelo obeleženi enzimom čije se delovanje na supstrat može meriti, a meri se absorbancija u UV ili VIS. � Pomoću EIA identifikuju se i/ili određuju Ag ili At u biološkim tečnostima i može da se koristi kao kvantitativni, semikvantitativni ili kvalitativni postupak. � a) EMIT- Enzyme multiplied Immunoassay techique, koristi se za određivanje malih molekula, pr. barbiturati, digoksin, fenition, teofilin, tiroksin itd. � b) ELISA – Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

III) Imunohemijske metode

III) Imunohemijske metode � 3) Fluoroimunohemijske metode (Fluoroimmuno. Assays-FIA) odnosno luminoimunohemijske metode (Luminescent. Immuno. Assays – LIA) su metode kojima se meri intezitet svetlosti nastale fluorescencijom, odnosno luminiscencijom. � Kod ovih metoda se pri merenju koristi tehnika zasićenja pri kojoj se Ag i obeleženi Ag* (obeležen radioizotopom, enzimom ili fluorescirajućom ili luminiscentnom grupom takmiče za aktivna mesta na At.

III) Imunohemijske metode �Prednosti: osetljivost i jednostavnost �Nedostatci: nisu potpuno selektivne, a različite serije antitela mogu mnogo da se razlikuju u aktivnosti i osetljivosti. �Primarno su semikvantitativne metode!

IV) Druge metode � 1) Metode sa izotopimaizotopi se specijalnim sintezama uvode u molekule lekova koji se nazivaju ‚‚obeleženi molekuli”, a to znači da sadrže merljive količine 14 C, 3 H(T), 2 H(D), 35 S itd. � Ove metode su skupe i mišljenja o upotrebi in vivo su podeljena.

IV) Druge metode � 2)Spektrometrijske metode – meri se apsorbancija svetlosti između određene talasne dužine karakteristične za određenu vezu ili veze između pojedinih atoma u nekom molekulu. � 3) Fluorimetrijske metode- meri se intenzitet svetlosti koju emituje neki deo organskog molekula posle obasjavanja svetlošću određene talasne dužine.

IV) Druge metode Spektrofotometrijskefluorimetrijske metode

IV) Druge metode � 4) Polarografske metode – zasnovane na praćenju redukcije nekog dela organskog molekula električnom strujom. Redukcija se izvodi na kapi žive koja ima određeni negativni potencijal koja se povećava tokom procesa, tj. meri se struja nastala redukcijom organskog molekula.