KRNYEZETVDELMI BIOTECHNOLGIA BIODEGRADCI BIOREMEDICI A krnyezet alkot elemei

KÖRNYEZETVÉDELMI BIOTECHNOLÓGIA BIODEGRADÁCIÓ, BIOREMEDIÁCIÓ A környezet alkotó elemei egymással szoros összefüggésben léteznek, az egyes elemekreható ártalmak a környezet egészére kihatnak. Ha a fennálló egyensúlyt megbontjuk, beláthatalan környezetvédelmi problémákkal találhatjuk szembe magunkat. Fejlődő ipar felhalmozódó hulladék veszélyes anyagok A Föld mikroflórájának válasza az újonnan megjelenő anyagokra adaptáció

Alapfogalmak Ø biotechnológia “biotechnologie - (EREKY Károly, 1917) all work by which products are produced from raw materials with the help of living organisms” [Ereky] Ø alkalmazott mikrobiológia - biokonverzió, biotranszformáció különböző (toxikus) vegyületek mikrobiális átalakítása - biodegradáció nem kívánatos, környezetre káros anyagok lebontása mikrobiális úton - bioremediáció (= tisztítás) a környezet megtisztítása a toxikus hulladékoktól mikrobiális módszerekkel Ø környezetvédelem - megelőzés - tervszerű környezetfejlesztés - környezetünk megóvása, védelme

A biotechnológiai eljárások szempontjából legfontosabb enzimek • • • oxidázok, hidroxilázok, dehydrogenázok reduktázok, hydrogenázok hidrolázok izomerázok proteázok, lipázok A biotechnológiában fontos mikroorganizmus csoportok • • • Metanogének Metilotrófok Clostridiumok Tejsav baktériumok Bacillusok Pseudomonasok Fotoszintetizáló baktériumok, algák Streptomycesek Élesztők Fonalas gombák

Metanogének: • archea • obligát vagy strict anaerobok • biogáz Metilotrófok: • aerobok • C 1 -C 3 szénforrások hasznosítása • pl. Metanotrófok metán oxidáció Clostridiumok: • • obligát anaerobok Gram pozitívok hőstabil endospóra rendkívül sokféle reakcióra képesek Tejsav baktériumok: • anaerobok • Gram pozitívok • élelemiszeripar Bacillusok: • aerobok • endospóra • extracelluláris enzimek Pseudomonasok: • • aerob heterotróf, Gram negatívok exopoliszaharidok biodegradáció Fotoszint. baktériumok, algák: • aerob vagy anaerob • biopolimerek • Fotoszintézis, CO 2 fixálás Streptomycesek: • aerob, spórázó szervezetek • antibiotikum termelők • extracelluláris enzimek Élesztők: • alkoholgyártás • pékélesztő Fonalas gombák: • • • heterotróf eukaryota szaprofita vagy parazita jellegzetes sejtfal spóraképzők antibiotikumok biokonverzió

XENOS = IDEGEN EREDETŰ SZINTETIKUS = NEM TERMÉSZETES Példák: peszticidek, herbicidek, oldószerek, egyes szerves vegyületek Lebontásukra megoldás: - fizikai - kémiai - biológiai módszerek Az 1960 -as évek elején felfedezték, hogy számos talajlakó mikroorganizmus képes a xenobiotikumok bontására Egyféle szennyezés ritkán fordul elő, ált. vegyes hulladék sokféle enzim, mikroorg. szükséges Legproblémásabb vegyületek az aromás, valamint halogén elem tartalmú vegyületek

Szerves oldószer hatása az organizmusra egyik fő támadáspont a membrán ahogy az oldószer akkumulálódik a membránban sérülnek annak funkciói: 1, aspecifikus permeabilizáció E. coli : fenol jelenlétében ATP és K+ szabadul ki a sejtekből toluol hatására RNS, foszfolipid és fehérje szivárgás 2, H+ és más ionok passzív áramlása membránon keresztül sérül az ATP szintézis 3, membránban lévő fehérjék funkciója is sérül 4, megváltozik, nő a membrán fluiditása változik a membrán struktúrája, stabilitása és membránon belüli kölcsönhatások membránfelszín hidrációs tulajdonságai változnak membrán vastagság változik membrán felszín növekedés

Adaptációs mechanizmusok védekezési mechanizmusok törzsről törzsre változnak I. Citoplazma és külső membrán adaptáció: mind lipid mind fehérje szinten cél: szolvens által megzavart membrán fluiditásának, stabilitásának újrateremtése I/1. zsírsav összetétel - megváltozik telített és telítetlen zsírsavak aránya alkohol és aceton növeli apoláris oldószerek pl. benzol csökkenti telítetlen zsírsavak arányát a membránban szaturáció változás fluiditás változás szolvens hatását kompenzálja "homoviszkózus adaptáció" - membránban telítetlen zsírsavak cis trans izomerizációja emeli a membrán rendezettségét és csökkenti a fluiditást

I/2. változik lipidek fejcsoportjainak összetétele P. putida: difoszfatidil-glicerol (kardiolipin) aránya nő P. putida Idaho: foszfatidiletanolamin nő I/3. foszfolipid szintézis fokozódik I/4. változik fehérje összetétel I/5. lipopoliszacharid összetétel változás külső membránban magának lipopoliszacharidoknak és lipoproteineknek is nő a mennyisége LPS hidrofóbicitás csökkentő hatása van I/6. külső membrán porinjai P. putida Omp. L mutáns: hiperszenzitív szolvensekre P. aeruginosa Omp. F hiány növeli a toleranciát I/7. zsíroldékony vegyületek Zymomonas mobilis: etanol jelenlétében hopanoidok mennyisége nő Staphylococcus aureus: olajsav jelenlétében karotenoid szintézis nő

II. sejtfelszín hidrofóbicitás csökkenése növeli a szolvens toleranciát P. putida toluol adaptáció után sejtek felszíne kevésbé hidrofób (sok fehérje és LPS) III. ionok stabilizáló szerepe Mg 2+, Ca 2+ stabilizálják Gr(-)-ok külső membránját pl. : Pseudomonas sp. - toluol IV. Szerves oldószerek degradációja vagy kevésbé toxikus formává való transzformációja V. Aktív exkréció a sejtből Biotechnológiai potenciál bioremediáció új, szerves oldószerekben stabil proteázok, lipázok egyéb enzimek

A biodegradációs eljárásokban legismertebb, leggyakrabban előforduló mikroorganizmusok Pseudomonasok Sphingomonasok Rhodococcusok Bacillusok Sugárgombák A (szubsztituált) aromás szerves oldószerek lebontására az oxigenáz, dehalogenáz enzimek alkalmasak

LEBONTÁSI ÚTVONAL LEHET AEROB, ANAEROB aerob: mono- és dioxigenázok anaerob: reduktív dehalogenáció, oxidált vegyületek: szulfát, nitrát

Aerob vs. anaerob metabolizmus

Aanerob metabolizmus benzoil-Co. A-n keresztül

Benzoil-Co. A konverziója acetil-Co. A-vá

Monooxigenázok (hidroxilázok) Monooxigenázok: az O 2 molekula egyik atomját építik be a célmolekulába SH 2 + O 2 = SO + H 2 O (internal monooxigenáz, a szubsztrátról jön az elektron) S + O 2 + H 2 X = SO(H) + OH-_ + X (external monooxigenáz) Példák: - p-hydroxybenzoát hydroxiláz család - phenol 2 -hidroxiláz - alkil csoport hidroxiláz (metán monooxigenáz) - kámfor 5 monooxigenáz (Citokróm P-450 család)

Dioxigenázok, hidroxilázok Aromás gyűrű hidroxilázok + Y X NADH+H+ NAD O 2 hidroxiláz OH OH X 4 -X-dihidroxihexadién Aromás gyűrűt hasító dioxigenázok X 4 -X-katekolát OH COOH CHO proximal-extradiol cleaving/ 2, 3 -dioxygenases R OH OH + O 2 R Sztereospecifikus hidroxilálás enzimatikus szintézisek COOH intradiol cleaving/ 3, 4 -dioxygenases R COOH CHO R OH distal-extradiol cleaving/ 4, 5 -dioxygenases

Mono- és dioxigenáz családok I.

Mono- és dioxigenáz családok II.

Mono- és dioxigenáz családok III.

METANOTRÓFOK: MMO=metán monooxigenáz Két fajta enzim: membrán kötött (p. MMO, Cu+), citoplazmatikus szolubilis (s. MMO, Cu-) p. MMO CH 4 O 2 Xred Xox s. MMO A metán oxidációja mellett NADH oxidáció (regenerálni kell) NADH+H+ s. MMO: széles szubsztráspecificitás több száz szerves vegyület oxidációja O 2 NAD+ H 2 O CH 3 OH bioremediáció további alkalmazás: metanolgyártás

Dioxigenázok, hidroxilázok Aromás gyűrű hidroxilázok + Y X NADH+H+ NAD O 2 hidroxiláz OH OH X 4 -X-dihidroxihexadién Aromás gyűrűt hasító dioxigenázok X 4 -X-katekolát OH COOH CHO proximal-extradiol cleaving/ 2, 3 -dioxygenases R OH OH + O 2 R Sztereospecifikus hidroxilálás enzimatikus szintézisek COOH intradiol cleaving/ 3, 4 -dioxygenases R COOH CHO R OH distal-extradiol cleaving/ 4, 5 -dioxygenases

Aromás gyűrűt oxidáló hydroxilázok

Hydroxilázok szerepe a bioorganikus kémiában Sphingomonas yanoikuyae biphenil dioxigenáz sztereoszelektív szintézisek például még a morfin, vagy a vanília szintézisében is

Hidroxilázok szerepe a biodegradációban

Hidroxilázok szerepe a klórozott vegyületek biodegradációjában

Az aromás diolok eddig ismert lebontási útvonalai

A gyűrűhasítás mechanizmusa intradiol extradiol

Szubsztituált (klórozott) szénhidrogénekre módosított ortho útvonal

Szubsztrátspecificitás Nem adaptált sejtek (periférikus útvonal) Adaptált sejtek (periférikus útvonal)

Szubsztrátspecificitás II. Centrális útvonal, specializálódott sejtek ezt az adott útvonal minden enzimjére meg kellene vizsgálni az útvonal mentén a specificitás változik az enzimek specfificitását bővíteni kell

Szubsztrátspecificitás bővítése a sejtek adaptációja, hosszú idő (6 – 8 hónap) irányított evolúció az útvonalak kombinálása egyesével, vagy. . .

A gének sokszor (mega)plazmidon vannak Plasmid Size (kb) Conjugative Incompatibility group Substrate Host Reference Peripheral pathways 9 TOL 117 + P-9 Xylenes, toluene, toluate 9, 100, 101, 102, 172 Pseudomonas putida 9 NAH 7 83 + P-9 Naphthalene via salicylate Pseudomonas putida 9, 37 37, 101, 139, 180, 181 17 p. WW 60 -1 87 + P-9 Naphthalene via salicylate Pseudomonas sp. p. DTG 1 83 + P-9 Naphthalene via salicylate Pseudomonas putida 17 145 9 SAL 1 85 + P-9 Salicylate Pseudomonas putida 9, 22 22, 101, 180, 181 5 p. KF 1 82 ND Biphenyl via benzoate Acinetobacter sp. (reclassified 5, 53 53 as Rhodococcus globerulus) 105 p. WW 100 200 ND Biphenyl via benzoate Pseudomonas sp. 105 methylbiphenyls via toluates 18 p. WW 110 >200 ND ND Biphenyl via benzoate Pseudomonas sp. 18 methylbiphenyls via toluates 2 p. CITI 100 ND ND Aniline Pseudomonas sp. 2 12 p. EB 253 ND ND Ethylbenzene Pseudomonas fluorescens 12 38 p. RE 4 105 ND ND Isopropylbenzene Pseudomonas putida 38, 39 39 175 p. WW 174 200 + ND Benzene Acinetobacter calcoaceticus p. HMT 112 ND ND Benzene Pseudomonas putida 175 157 94 p. EST 1005 44 ND ND Phenol Pseudomonas putida 94 8 p. VI 150 mega + P-2 Phenol, cresols, Pseudomonas sp. 8, 146 3, 4 -Dimethylphenol Central pathways 26 p. AC 25 117 + P-9 3 -Chlorobenzoate Pseudomonas putida p. JP 4 77 + P-1 3 -Chlorobenzoate, 2, 4 -D Ralstonia eutropha (formerly 26 33 33 Alcaligenes eutrophus) 179 p. BR 60 85 + ND 3 -Chlorobenzoate Alcaligenes sp. 179 28 p. RC 10 45 p. P 51 100 ND ND 2, 4 -D Flavobacterium sp. ND 1, 2, 4 -Trichlorobenzene Pseudomonas sp. 28 165 14 p. MAB 1 90 ND ND 2, 4 -D Burkholderia (formerly Pseudomonas cepacia a. ND, not determined; 2, 4 -D, 2, 4 -dichlorophenoxyacetate. 14

Operon struktúrák benzoesav bontás bifenil bontás módosított orto útvonal

Szabályozás a transzkripciós faktor szubsztrátspecificitása

Metabolikus útvonalak kombinálása keresztezéssel 2. plazmid 1. plazmid 3. plazmid konjug. A törzs 4. plazmid konjug. B törzs Plazmid rekombináció C törzs D törzs konjugáció F törzs E törzs Strain G Problémák azért még vannak