VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO

VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO

VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO ® Virus ADN, 8. 000 pb, familia Papillomaviridae, grupo Papoviridae - Tropismo por epitelio queratinizado - Muy específicos de especie: humanos y animales ® Genoma circular de doble hélice - Genes tempranos (E 1, E 2, E 4 -E 7) - Genes tardíos (estructurales): proteínas L 1 y L 2 ® Cápsula sin envoltura - Proteína mayor L 1 (inmunógena) - Proteína menor L 2 ® Se clasifican en tipos en base a una diferencia de al menos un 10% en la secuencia genética de L 1 - Se conocen más de 100 genotipos ® La infección por el VPH se considera causa necesaria del cáncer de cérvix.

CLASIFICACIÓN PATOGÉNICA DE LOS TIPOS DE VPH ® Afinidad por la piel: VPH cutáneos: ® Lesiones verrucosas de la piel Verrugas cutáneas y plantares (papilomas) ® Epidermodisplasia verruciformis ® ® Afinidad por las mucosas: VPH mucosos: ® 40 tipos Bajo riesgo oncogénico: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 55, 61, 62, 67, 69, 70, 71, 72, 81, 84, 89 ® Verrugas genitales (condilomas acuminados) ® Displasia cervical de bajo grado (no evolutiva) ® ® Papilomatosis respiratoria recurrente ® Alto riesgo oncogénico: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 Cáncer cervical ® Cáncer de ano, vagina, vulva, pene ® Cáncer orofarígeo ® De probable alto riesgo oncogénico: 26, 53, 66, 68, 73, 82 ® Relación genética entre los virus oncogénicos más frecuentes: Especie A 9: 16, 31, 33, 35, 52, 58 Especie A 7: 18, 39, 45, 59

VÍAS DE TRANSMISIÓN DEL VPH ® Vías primarias de infección por el VPH ® Coito vaginal ® ® Coito anal Otras vías de transmisión establecidas (poco comunes): ® Contacto oral-genital ® ® Contacto digital-genital Otras vías no establecidas pero plausibles: ® Uso compartido de objetos en contacto con el área ano-genital ® La infección genital no implica necesariamente relación sexual, pero la mayoría se relacionan con sexo sin preservativo. ® Dinámica de la transmisión sexual (Nº parejas, Temporalidad relación, Patrón apareamiento concordante edad, Diferencias de género, Factores protectores)

PREVALENCIA DE LA INFECCIÓN EN ESPAÑA CastellsaguéX et al. Human Papillomavirusand Related Diseases in Spain. PREHDICT edition. Summary Report 2013. CastellsaguéX et al. The. CLEOPATRE study. J. Med. Virol. 2012

INFECCIÓN POR VPH ® ® CIN= Neoplasia Intraepitelial Cervical (-1, -2 -3) HSIL= Lesiones Intrapiteliales Escamosas de Alto grado (CIN-2, CIN-3) LSIL= Lesiones Intrapiteliales Escamosas de Bajo grado (CIN-1) AIS= Adenocarcinoma in situ / Adenocarcinoma invasivo Ø Ø ASCUS= Atipia de Células Escamosas de Significado Incierto AGUS= Atipia de Células Ganglionares de Significado Incierto

INFECCIÓN POR VPH ® Impacto del VPH y SIL en España (1996 -2000) Cáncer invasor (1) HSIL (3) 2. 000 16. 000 ASCUS/LSIL (2) 497. 000 VPH + (2) 655. 000 MUJERES (1) (15 - 74 años) 15. 640. 000 (1) Estimación basada en Globocan 2000. (2) Estimación basada en estudios de población general estratificados por edad en 2 áreas urbanas de Cataluña (rango: 2 -7%). (3) Estimación de un 0. 1% de prevalencia de HSIL basado en (2)

INFECCIÓN POR VPH Sylvia Michelina. Fernandes Brenna; Kari Juhani Syrjänen Sao Paulo Med. J. vol. 121 no. 3 Sao Paulo 2003

ESTRUCTURA GENÓMICA DEL VPH ® Consta de varios genes u “Open Reading Frames” (ORF) de dos tipos diferentes: ® Hasta 8 genes de expresión temprana o “early” (E 1 -E 8) cuya expresión se traduce en proteínas para la regulación y replicación viral Los genes de expresión temprana “Early” presentan secuencias muy variables por lo que se han utilizado para la detección específica del tipo. genes E 6 y E 7: oncogenes que interactúan con p. RB y p 53, moléculas de control del ciclo celular. ® 2 genes de expresión tardía o “late” (L 1, L 2) que generan las proteínas para la unión de la cápside. Son inmunogénicos. Los genes de expresión tardía “Late” presentan secuencias muy semejantes entre los diferentes tipos de VPH. gen L 1 principal diana “consenso” de detección ® Una región URR ó LCR que controla la expresión de los genes tempranos E 6 y E 7

INFECCIÓN POR VPH ® La integración aumenta el riesgo de cáncer - I Efecto Forma del VPH en la célula • Expresión del gen E 6 controlada por E 2 Episoma E 6 Después de la integración p 53 PA • La expresión de E 6 deja de estar controlada • Bloqueo de la actividad de p 53 • Resistencia a la apoptosis Asociación de E 6 con • Aumento de la p 53 y PA inestabilidad cromosómica

INFECCIÓN POR VPH ® La integración aumenta el riesgo de cáncer - II Forma del VPH en la célula Efecto • Expresión del gen E 7 controlada por E 2 Episoma p. RB E 7 • La expresión de E 7 deja de estar controlada + Después de la integración Libre E 2 F • Generación de múltiples cromosomas • Inmortalización celular • Oncogénesis Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs. 11– 46.

HISTORIA NATURAL DE LA INFECCIÓN POR VPH Años Meses Décadas Inicio actividad sexual Epitelio Normal Infección VPH LSIL CIN 1 Producción de virus CIN 2 CIN 3 HSIL No producción/ ↓ diferenciación celular 20% 80% 10 -15 años CIN= Cervical Intraepithelial Neoplasia SIL= Squamous Intraepithelial Lesion Ca. Cérvix

HISTORIA NATURAL PATOLOGÍA ONCOLÓGICA VPH INFECCIÓN VPH CÁNCER PRE-CÁNCER 15 30 *Adaptado de Schiffman et al. NEJM. 2005 45 60 Edad (años)

HISTORIA NATURAL PATOLOGÍA ONCOLÓGICA POR VPH

INFECCIÓN POR VPH 72, 4% 93, 9%

Factor de riesgo: VPH PREVENCIÓN 1 ARIA: VACUNACIÓN ANTI-VPH Lesiones pre-neoplásicas PREVENCIÓN 2 ARIA: DETECCIÓN VPH Cáncer invasivo de cérvix Muerte Adaptado de: Chapter 20. Franco EL et al. In: HPV Vaccines and Screening in the Prevention of Cervical Cancer. 2006 Vaccine, Vol 24 Supplement 3, 2006. © 2006 Elsevier Limited. All rights reserved. Chapter 20, Figure 1 ESTADÍOS PREVENCIÓN DEL CÁNCER DEL CÉRVIX BASADA EN EL HPV

VACUNAS VPH - VLP L 1 Mediante recombinación se producen proteínas L 1 que se ensamblan simulando el virus. Éstas son casi idénticas a nivel morfológico y antigénico al virus. De ahí su nombre VLP: “Virus Like Particles” • No son infecciosas ni oncogénicas • Son altamente inmunógenas • Múltiples ensayos clínicos han demostrado alta inmunogenicidad, seguridad y eficacia de las vacunas *Schiller et al. Vaccine. 2008

VACUNAS VPH - VLP L 1 Merck / SPMSD GSK Gardasil® Cervarix® VPH 6, 11, 16 y 18 VPH 16 y 18 § VLPs de L 1 de VPHs 6, 11, 16 § VLPs de L 1 de VPHs 16 y 18 § Producción: “levaduras” § Producción: baculovirus § Adyuvante: Aluminio § Adyuvante: AS 04 § Pauta: 0, 2 y 6 meses (0, 5 ml, § Pauta: 0, 1 y 6 meses (0, 5 ml, IM) *Schiller et al. Vaccine. 2008 IM)

VACUNACIÓN FRENTE AL VPH EN ESPAÑA CERVARIX 13 14 GARDASIL Cuadrados proporcionales a la población a vacunar. Cifra es el num. de niñas con la edad correspondiente* Centro salud Escuela 14 2, 171 3, 441 13 8, 036 10, 237 15 2, 653 12 2, 783 11 14 14 9, 692 1, 342 14 1, 328 11 32, 050 5, 450 14 27, 768 14 Edad Vacunación 14 14 Edad catch-up 14 14 22, 517 9, 902 5, 467 14 5, 036 14 14 7, 321 42, 113 14 10, 231 13 434 14 457 * INE 2009

PROTECCIÓN CRUZADA DE LAS VACUNAS REVISIÓN DEL PROGRAMA DE VACUNACIÓN FRENTE AL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO EN ESPAÑA Grupo de trabajo VPH 2012 INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 2013 MINISTERIO DE SANIDAD, SERVICIOS SOCIALES E IGUALDAD ® ® Eficacia de la protección cruzada: se mide en función de la protección frente a “enfermedad persistente(>6 meses)” y frente a “CIN 2+/AIS” en la población naive de mujeres vacunadas seronegativas y DNA-PCR (-) frente a los genotipos no vacunales individuales (31, 33, 45…) o agrupados. VACUNA BIVALENTE, frente a cualquier otro oncotipo: CIN 2+…. . 64, 9% CIN 3+…. . 93, 2% VACUNA TETRAVALENTE, frente cualquier otro oncotipo: CIN 2+/AIS… 42, 7% PROTECCIÓN TOTAL (datos conjuntos): 80%. . . . 72, 4% oncotipos 16, 18 ……. 7, 6% protección cruzada otros oncotipos

EFECTIVIDAD, EFICACIA, REEMPLAZO Y COSTE-BENEFICIO ® Efectividad comprobada hasta 6 años, permite estimar una efectividad permanente. ® Seguimiento eficacia: ↓CIN 2+/infección persistente//efectividad títulos Ac/sero+ ® Reemplazo oncotipos: No se ha demostrado trs 5 años de seguimiento VPH ha permanecido estable geneticamente durante milenios Poco probable su mutación para adaptarse al nuevo nicho ecológico. ® Coste-beneficio: precio/dosis 100€……. . 31€

EVOLUCIÓN TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS VPH Revisión de las pautas de screening Coilocito / Efecto citopatico HPV Dürst et al. 1983 VHP+ 99, 7% Cánceres de Cérvix 1 P 16 CINTec Cervatec p 16 ELISA LBC: Citología líquida L 1 Ag Cytoactiv Thin. Prep® Sure. Path® ONCOTEC m. RNA E 6/E 7 Screening 1º basado en DNA HPV Test de Papanicolau 1949 1 Walboomers Prevención Secundaria Prog. Base Poblacional Finlandia 1963 -2008 PCR 1980 1990 s LBC 1996 1999 et al. , Journal of Pathology 189: 12 -19, 1999 ( Modificado ) HC-2 / H Ventana Amplicor* Roche DNA Invader* WD 2000 s 2003 2008 PREVENCION PRIMARIA ESCENARIO POSTVACUNAL

MÉTODOS DE DETECCIÓN DEL VPH 1. Citología Papanicolau / citología líquida Automatización de la lectura. 2. Colposcopia / Microcolposcopia Colposcopia computarizada 3. Métodos moleculares basados en la detección de ADN / RNA viral 4. Métodos basados en la detección de patrones de expresión de proteínas: p 16 INK 4 CERVATEC-ELISA / Cit/ Tej. 5. Métodos SEROLOGICOS de detección de Ac. contra HPV

MÉTODOS MOLECULARES DETECCIÓN ADN VPH 1 - Hibridación in situ (ISH), Hibridación de DNA Disponible en prueba coktail. 2 - Hibridación seguida de “amplificación de la señal” Hybrid Capture 2 (HC 2 R , Qiagen): RNA probe Coktai Invader Tecnology: Third Wave invader HPV test Hibridación ADN/ARN. Cóctel de sondas: Alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68. Bajo riesgo: 6, 11, 42, 43 y 44. Sensibilidad adecuada a procesos de cribado de VPH (1 pg/m. L). Aprobado por la FDA. Posibilidad de semicuantificar. Estandarizada y automatizable. Detecta de forma cruzada otros genotipos. LIMITACIONES: Prueba dependiente del estado de conservación del DNA viral La semicuantificación de la Carga Viral solo indica el nº de copias No distingue los diferentes tipos virales No detecta infecciones múltiples Se dan reacciones cruzadas entre las sondas de alto riesgo y ciertos tipos virales de bajo riesgo. La mayoría de las muestras discordantes HCII+ están relacionadas con un valor bajo de RLU y reactividad cruzada con genotipos de bajo riesgo

MÉTODOS MOLECULARES DETECCIÓN ADN VPH 3 - PCR multiplex: “Amplificación de DNA con primers consenso” Real time HR-HPV ( Aboot) AMPLICOR R ( Roche) • • Es la técnica molecular más sensible y flexible. Puede ser utilizada para la detección, la cuantificación, la secuenciación y el análisis mutacional. La cuantificación del producto resulta compleja (estándares internos). Exige del laboratorio y del personal una normas y unas condiciones especiales.

DETECCIÓN DEL VPH: GENOTIPADO

ESTRATEGIAS DE GENOTIPADO DE VPH PCR Primers de consenso GP 5+/6+ PGMY SPF 10 MY 09/11 primers específicos Hibridación reversa RFLP Array PCR en tiempo real Secuenciación

ESTRATEGIAS DE GENOTIPADO DE VPH Hibridación reversa LIPA (INMUNOENSAYO LINEAL) Amplifica pequeños fragmentos de 65 bp en la región L 1 (primers SPF). Detecta 25 tipos de VPH e infecciones múltiples. • • LINE-BLOTTING (PGMY-LB) Amplifica la región L 1 con mezclas de primers (PGMY 09/PGMY 11) y el gen de la betaglobina humana, ambos biotinados. El producto amplificado se hibrida con sondas de 37 tipos de VPH fijadas a una membrana de nitrocelulosa. LIPA Vs. LINE-BLOTTING Concordancia 80, 6 Compatibilidad 11, 2 Discordancia 8, 2 Valor kappa 0, 79 (Kleter et al. J Clin Microbiol 1999; 37: 2508 -17. Gravitt et al. J Clin Microbiol 1998; 36: 3020 -7. Kornegay et al. J Clin Microbiol 2003; 41: 1080 -6. Van Hamont et al. J Clin Microbiol 2006; 44: 3122 -9. )

ESTRATEGIAS DE GENOTIPADO DE VPH RFLP (patrón de restricción con endonucleasas) • Método que permite combinar la sensibilidad de la PCR con el poder discriminatorio de las endonucleasas de restricción. • Es un sistema poco laborioso y menos costoso que LIPA y secuenciación. • Resulta difícil detectar infecciones mixtas. Bernard et al. J Infect Dis 1994; 170: 1077 -85. Wang et al. J Med Virol 1999; 59: 536 -40. Kay et al. J Virol Meth 2002; 105: 159 -70.

ESTRATEGIAS DE GENOTIPADO DE VPH Hibridación con microarrays • • Tras una PCR de la región L 1, que marca el producto amplificado, se hibrida con oligonucleótidos dispuestos en microarray. Se generan sondas a cada tipo de VPH y se fijan a los pocillos de reacción. Se amplifica la muestra con primers genéricos marcando con Cy 5 el producto amplificado. Hibridación y lectura. (An et al. Cancer 2003; 97: 1672 -80. Oh et al. J Clin Microbiol 2004; 42: 3272 -80. Gheit et al. J Clin Microbiol 2006; 44: 2025 -31. )

ESTRATEGIAS DE GENOTIPADO DE VPH Secuenciación de ADN La secuenciación de Sanger se basa en la polimerización del ADN y el uso de dideoxinucleótidos que sirven como terminadores de la reacción. En la actualidad la reacción de secuenciación se basa en una modificación de la PCR con dideoxinucleótidos marcados con fluoróforos y se resuelve mediante una electrofoesis capilar. La información obtenida en los secuenciadores automáticos se guarda en ficheros binarios que incluyen un cromatograma.

ESTRATEGIAS DE GENOTIPADO DE VPH Real. Time-PCR Real Time PCR (RT-PCR) permite controlar el progreso de la reacción de PCR a medida que esta ocurre. El RT-PCR usa marcado fluorescente para monitorear la amplificación de productos durante cada ciclo de reacción (detección de la cinética de la reacción). Esta técnica combina los pasos de amplificación de ADN y la detección en un único ensayo. La cuantificación de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR será proporcional a la cantidad de ADN amplificado

SENSIBILIDAD + Hibridación in situ Southern blot Sonda directa HC II Señal amplificada PCR real time PCR Amplificación de la diana

Evolución de la tecnología diagnóstica del VPH y relación de causalidad con el cáncer de cérvix ADN-VPH EN CÁNCER CERVICAL 30%-60% 75% 99% SENSIBILIDAD + SOUTHERN TESTS PARA LA DETECCIÓN FISH DE ADN-VPH TS. PCR; L 1. PCR GP. PCR HC III realtime-PCR 1980 1990 2000 (Bosch et al. J Clin Pathol 2002; 55: 244 -65. )

RECOMENDACIONES DE CRIBADO Oncoguía SEGO Prevención del Cáncer de Cuello de Útero 2014

UTILIDAD DE LOS TEST VPH-ADN Hibridación In situ (ISH) PCR Captura Híbrida 2 (HCII, Digene) ® ® Valor predictivo negativo – Si test VPH positivo , NO significa que desarrollará cáncer, la mayoría de mujeres que están infectadas no lo desarrollan – Si test VPH negativo, es muy difícil que se desarrolle el cáncer El verdadero valor del test está en muestras negativas (Cribado 3 a 5 años) Sólo detectan infecciones muy prevalentes, de las cuales 70% de las infecciones desaparecen en 1 año, y un 91% en dos años (sin ningún tipo de tratamiento) Sólo las infecciones persistentes tienen riesgo de desarrollar lesiones precancerosas de alto grado y cáncer ( aprox. 10% de mujeres con el virus. ) Por tanto, estos tests presentan limitaciones que las tecnología basada en la determinación de proteínas virales pretende resolver

MÉTODOS PREDICTORES DE PROGRESION Determinación de la carga vírica ® No se correlaciona bien con el nivel de lesión histológica. ® Hay que distinguir la alta carga vírica previa al aclaramiento del virus y la que es consecuencia de la persistencia del virus. ® Únicamente se ha demostrado que tiene valor en las infecciones simples por HPV 16. Gravitt et al. , Int J Cancer, 2007, 121, 2787. Briolat et al. , Int J Cancer, 2007, 121, 2198.

MÉTODOS PREDICTORES DE PROGRESION Carga viral total / Carga viral relativa CVR= CVT : nº cel.

MÉTODOS PREDICTORES DE PROGRESION Integración del ADN vírico en el cromosoma celular • La integración del ADN vírico conduce a la sobreexpresión de E 6 y E 7 • Utiliza técnicas de hibridación in situ (FISH) con sensibilidad incrementada (HPV-CARD) • El ADN integrado ó episómico presenta diferentes patrones de visualización

MÉTODOS PREDICTORES DE PROGRESION Detección de ARNm de E 6/E 7 del VPH • • La expresión de E 6 y E 7 puede medirse por sus niveles de ARNm. Es un marcador indirecto de integración vírica. Tiene mayor valor predictivo positivo que otras técnicas moleculares en lesiones de bajo grado. Existen comercializadas en formato de NASBA y FISH. et al. Gynecol Oncol 2005; 97: 908 -15. )

MÉTODOS PREDICTORES DE PROGRESION Detección de ARNm de E 6/E 7 del VPH: Pre. Tect HPV- Proofer HPV Oncotect

SIGNIFICACIÓN DIAGNÓSTICA TEST VPH-ADN Hibridación In situ (ISH) Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) Captura Híbrida 2 (HCII, Digene/Quiagen) VPH negativo VPH positivo La mujer no se encuentra infectada por VPH. Es muy difícil que se desarrollen lesiones severas o cáncer Alto Valor predictivo negativo (VPN) La mujer esta infectada por VPH Bajo Valor predictivo positivo (VPP) NO significa que desarrollará cáncer, la mayoría de mujeres que están infectadas no lo desarrollan Un 90% de las infecciones se aclaran en 2 años (cribado 3 a 5 años)

SIGNIFICACIÓN DIAGNÓSTICA TEST VPH-ARNm HPV Onco. Tect negativo HPV Onco. Tect positivo No hay expresión de oncoproteínas Aunque el virus este presente no hay actividad oncogénica Presencia de oncoproteínas en el exocervix. Existe actividad celular anormal, integración viral y alta probabilidad de progresión. Alto Valor predictivo negativo (VPN) Alto Valor predictivo positivo (VPP) Alta correlación con progresión

UTILIDAD CLÍNICA ARNm-VPH • VPH ARNm E 6/E 7 como marcador clínico para la detección precoz del cáncer de cérvix 1: detección de VPH m. RNA E 6/E 7 indica la actividad oncogénica del VPH y no sólo la presencia de una infección frecuente (tests de VPH ADN) ü Es el indicador clínico más relevante para el desarrollo del cáncer de cérvix, y puede ser usado como un marcador clínico predictivo para identificar aquellas mujeres con riesgo alto de desarrollar lesiones displásicas de alto grado y cáncer • ü Debido a la integración del VPH y la fragmentación del ADN, en muchos casos los tests basados en detección de ADN darán resultado negativo 2: 425% casos Sería un método de cribado ideal³ aquel que incidiera en la detección de la transcripción activa de oncogenes VPH-AR o de las proteínas resultantes de su expresión (1) HPV Hand. Book: "Human Papillomavirus and Cervical Cancer", edited by Professor Walter Prendiville and Dr Philip Davies, supports detection of oncogenic activity (page 75 and 76): (2) Sankaranaryanan et al. , Accuracy of human papillomavirus testing in primary screening of cervical neoplasia: results from a multicenter study in India. International Journal of Cancer 112: 341 -347, 2004 (3) Documento de consenso SEGO: “La infección por papilomavirus”.

MÉTODOS BASADOS EN LA DETECCIÓN DE PATRONES DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS Cervatec TM p 16 INK 4 a ELISA • Es un ensayo Sanndwich con enzimas unidas a un inmunoadsorvente. • El dispositivo de inmunoensayo está basado en el uso de Ac. monoclonales específicos marcados con cromógeno para p 16 ( la proteína solubilizada de muestras cervicales lisadas en pocillos de microplacas). • Se obtiene una señal cromogénica proporcional a la concentración de p 16. • El kit ELISA proporciona los reactivos para la estandarización de la señal del ensayo así como los controles apropiados.

p 16 INK 4 Inmunocytochemistry on liquid-based cytology SCORE 1 SCORE 2 Cancer cytopatology 2005; 105: 465 -7

p 16 INK 4 Inmunocytochemistry on liquid-based cytology SCORE 3 SCORE 4 Cancer cytopatology 2005; 105: 465 -7

Expresión de P 16 Individuos en riesgo Infección HPV Persistente Pacientes con Enfermedad Desregulación Celular CIN Alto grado HPV test (PCR) Citología Nuevo biomarcador (p 16 INK 4 a ) Cancer Invasivo

ALGORITMO FRENTE A CRIBADO POSITIVO Oncoguía SEGO Prevención del Cáncer de Cuello de Útero 2014

INFECCIÓN POR VPH

Criteria for assessment of p 16 INK 4 a POSITIVE CELLS • Nuclear size and nuclear-cytoplasmic ratio: nucleus significantly enlarged >50% • Hipercromasia and nuclear texture: coarse and inhomogeneous cromatin • Nuclear shape and membrana structure: Irreg. of the nuclear shape/or border. • Anisonucleosis Cancer cytopatology 2005; 105: 465 -7

SIGNIFICACIÓN DIAGNÓSTICA TEST VPH-ARNm HPV Onco. Tect negativo HPV Onco. Tect positivo No hay expresión de oncoproteínas Aunque el virus este presente no hay actividad oncogénica Presencia de oncoproteínas en el exocervix. Existe actividad celular anormal, integración viral y alta probabilidad de progresión. Alto Valor predictivo negativo (VPN) Alto Valor predictivo positivo (VPP) Alta correlación con progresión

La CARGA VIRAL Y LA INTEGRACION valor en la predicción de Progresión PCR a tiempo real: • Asigna valores cuantitativos reales a los amplificados • Usa sondas específicas marcadas con fluorocromos (Taqman, Scorpions) • Se mide la excitación lumínica ciclo ( Laser + Cámara CCD) • Análisis de regresión de las variaciones de niveles lumínicos con elaboración de línea gráfica donde extrapolar los valores iniciales cuantitativos para cada gen estudiado. Carga viral: • Permite la comparación de las cantidades de un determinado gen viral con un gen celular constitutivo. • Permite determinación de CV Total • Determinación de CV Relativa: CVR = CVT : nº de cel. ( Gen Constitutivo) Estado de integración: Análisis de la proporción de E 6 -7 con el gen susceptible de pérdida de E 2 • , Episomal: E 6 -7 = E 2 • Integración total: E 2 = 0 • Formas episomales e integradas: E 6 -7> E 2

INFECCIÓN POR VPH

ALGORITMO FRENTE A CRIBADO POSITIVO Oncoguía SEGO Prevención del Cáncer de Cuello de Útero 2014

RECOMENDACIONES DE CRIBADO Oncoguía SEGO Prevención del Cáncer de Cuello de Útero 2014

Proposed new screening algorithm Women aged 25 -64 y HPV Test Negative Normal 5 year recall Positive Normal or Borderline HPV test and Cytology at 6 -12 months Cyto Neg HPV Neg Normal 5 Year Recall EUROGIN November 2008 HPV+ and Cyto >mild HPV – and Cyto Borderline HPV and Cytology at 6 -12 months CYTOLOGY =/> Mild Colposcopy Cyto=/> Mild Colposcopy

INFECCIÓN POR VPH

Tests de detección de RNA Métodos de amplificación de RNA isotérmicos Pre. Tec HPV-Proofer ( Norchip): 5 genotipos HR-HPV APTIMA Gen. Probe: 13 Genotipos HR-HPV. Detección m. RNA sin destrucción celular: ONCOTEC Hibridación in situ con fluoresceina ( FISH)+ citometría de flujo

INFECCIÓN POR VPH

Tecnología aplicada en el Estudio CERVATEC Cervatec TM p 16 INK 4 a ELISA • Es un ensayo Sanndwich con enzimas unidas a un inmunoadsorvente. • El dispositivo de inmunoensayo está basado en el uso de Ac. monoclonales específicos marcados con cromógeno para p 16 ( la proteína solubilizada de muestras cervicales lisadas en pocillos de microplacas). • Se obtiene una señal cromogénica proporcional a la concentración de p 16. • El kit ELISA proporciona los reactivos para la estandarización de la señal del ensayo así como los controles apropiados.

HISTORIA NATURAL INFECCIÓN POR VPH ® La infección por HPV-HR produce una lesión morfológíca con fuerte tendencia a la regresión y muy baja a la progresión ( Moscicki 2004; Castle 2005) ® La resolución de la infección confiere inmunidad. ® Una infección posterior por el mismo genotipo debe atribuirse a una reactivación de una infección latente = explicar el aumento de prevalencia en mujeres >60 años ( Silvia de Sanjosé 2006) ® En el proceso de carcinogénesis los eventos moleculares no se correlacionan con las categorias morfológicas. ( Gran variabilidad interobservador del CIN II) ® La probabilidad de que un HSIL regrese a LSIL es 3 veces mayor de que suceda lo contrario. (Cantor et al 2005) ® Pueden aparecer lesiones de alto grado en ausencia de LSIL. (Schiffman et al 2005) ® La carcinogenesis precisa de una infección persistente Inf. 7 -15 a. CIN III 10 a. C. E. I. ( Bosch y Sanjose , 2003)

Método HPV Onco. Tect HPV E 6, E 7 ARNm - Cels CÉLULAS exocervicales con secuencia diana Fluorocromo unido a sonda de ADN complementaria a ARNm HPV E 6, E 7 ARNm+ Cels (%) Etiqueta anticuerpos FIJAR/ PERMEABILIZAR (R 1, R 2, R 3) ARNm E 6/E 7 CITÓMETRO DE FLUJO + CALOR/LAVADO (R 6/R 7) Debri s OLIGONUCLEÓTIDOS marcados con fluorocromo (R 5) ATTAGAAT P M Ns Células endocer Células vicales exocervi cales

Detección de ARNm de E 6/E 7 del VPH: Pre. Tect HPV- Proofer • • Amplificación de diana ARN (NASBA) Utiliza sondas específicas (molecular beacons) Determina 5 genotipos: 16, 18, 31, 33 y 45 Correlaciona con otros marcadores de progresión histológicos (p 16 INK) pero no con la carga vírica. Molden et al. , J Virol Meth, 2007, 142, 204. Andersson et al. , Int J Oncol, 2006, 29, 705

Detección de ARNm de E 6/E 7 del VPH: HPV Oncotect • Técnica de FISH • Directamente de citología líquida. • Se realiza en menos de 3 horas • Lectura en citómetro de flujo • En muestras de LSIL: - Sensibilidad 83. 3% - Especificidad 91. 3% Narimatsu y Patterson, Am J Clin Pathol, 2005, 123, 716.

INFECCIÓN POR VPH

Determinación de p 16: Citologías y Biopsias: • Aumenta la concordancia inter-observador • Aumenta la sensibilidad y especificidad de los resultados respecto de HC-II para detectar lesiones de alto grado (HSIL). Fluido vaginal: Cervatec p 16 ELISA Estudio CERVATEC. Conclusiones preliminares: Alta sensibilidad (93%) para identificación de HSIL en mujeres < 35 años Especificidad del (92%) La especificidad se incrementa al 97% cuando se combina con test de HPV