Virus del Papiloma Humano Deteccin y Vacunas Dra

Virus del Papiloma Humano, Detección y Vacunas Dra. Marcela Lizano Soberón

ØInfección PERSISTENTE con VPH como causa necesaria para el desarrollo de Ca. CU Ø Enfermedad de transmisión sexual Ø Genoma del VPH 99% en Ca-CU Zur Hausen, 1977; Bosch, 2002; de Villiers, 2004.

Criterios para determinar papel viral en la carcinogénesis (zur Hausen 2001) Presencia regular y persistencia del respectivo DNA viral en biopsias tumorales y líneas celulares derivadas de dichos tumores. Demostración de promoción de crecimiento por genes virales específicos, en cultivos celulares o modelos animales disponibles. Demostración de que el fenotipo maligno depende de la expresión contínua de oncogenes virales. Evidencias epidemiológicas de la infección viral como factor de riesgo para el desarrollo del cáncer.

FACTORES HORMONALES VIDA SEXUAL STRESS TABAQUISMO OTROS HPV SISTEMA INMUNOLOGICO DESNUTRICION ALTERACION DE LA RESPUESTA INMUNE LOCAL FACTORES GENETICOS Cáncer Cérvico Uterino

Epidemiología del VPH de alto riesgo en el 99% de los cánceres de cérvix. Walboomers JM et al. 1999. J Pathol. 189: 12. 15 -43% prevalencia de VPH en mujeres con citololgía normal. Orozco-Colín 2010. Int J Infect Dis. 14: 1082. Kasan et al. 2011. Eur J Obster Gynecol Reprod Biol. Jul 14. ~70% de la mujeres estarán infectadas por VPH en algún momento de su vida. La mayor parte de estas infecciones serán transitorias. Koutsky et al. N Engl J Med 2002, 347: 1645

El virus del papiloma humano y el cáncer cérvico-uterino Menos del 2% de los individuos infectados Infección VPH persistencia NIC 2+ invasion Integración Normal Tipo de VPH/ variantes intratipo Carga Viral Predisposición genética Respuesta inmune

Incidencia de infecciones por HPV, precáncer y cáncer Lowy & Schiller. J Clin Invest. 116: 1167, 2006

Relaciónevolutivaentre. VPHs J. Doorbar et al. / Vaccine 30 S (2012) F 55– F 70

Papilomavirus Alpha y asociación con enfermedad Doorbar J et al. / Vaccine 30 S (2012) F 55– F 70

Genoma del VPH Región Larga de control Oncogenes Replicación Proteínas de la cápside Replicación y transcripción

Efecto de Integración del DNA viral al genoma hospedero X X

Ciclo de vida de VPH en el epitelio cervical

Woodman CBJ et al. , Nat Rev 2007; 7: 11.

Patogénesis del cáncer de cérvix zur Hausen

Información relevante de VPH y Ca. CU La infección por VPH es muy común El Ca. CU siempre es causado por el VPH Tener VPH no significa que la mujer desarrollará Ca. CU. Más del 90% de las infecciones detectadas se eliminan en los siguientes 2 años. La infección con VPH de alto riesgo que persiste por más de 4 años aumenta el riesgo al cáncer por 100 x

Los VPH se detectan prácticamente en todos los casos de Ca. CU y en una proporción de sus lesiones precursoras. La infección por VPH es la CAUSA NECESARIA del cáncer de cérvix, pero NO SUFICIENTE. Una vacuna totalmente eficaz contra VPH 16 y 18 eliminaría cerca del 70% de los cánceres de cérvix.

La estrategia completa para eliminar el cáncer involucra la detección temprana, el tratamiento y la prevención

Prevención Primaria Vacunación Intento prometedor para reducir incidencia y mortalidad de Ca. CU Secundaria Detección oportuna del cáncer El primer factor en el pronóstico es la detección en etapas tempranas de la enfermedad: - Pap - Colposcopía - Detección de ADN de VPH de alto riesgo Tratamiento oportuno de lesiones premalignas

Diagnóstico molecular de VPH Los modelos de cultivo in vitro son poco eficaces y costosos. Los anticuerpos carecen de valor diagnóstico. La detección de DNA de VPH aporta una excelente sensibilidad que debe ser valorada cuidadosamente debido a la ubicuidad del virus. Las mujeres infectadas con VPH-AR se encuentran en mayor riesgo de desarrollar Ca. CU que las infectadas con tipos de VPH de bajo riesgo. Manejo menos agresivo en mujeres VPH neg con anormalidades citológicas leves o equívocas, dado que es poco factible que progresen.

Mayor sensibilidad de detección de LIE de alto grado 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 89. 2% 96. 9% 76. 2% Pap Prueba VPH Pap + VPH Sensibilidad Participantes: 995 mujeres con ASCUS Manos, M. M. , et al. , Identifying Women With Cervical Neoplasia. JAMA, May 5, 1999

Sensibilidad de distintas técnicas de detección de VPH Hibridación in situ Southern blot Sonda directa PCR en tiempo real Señal amplificada

Toma de muestra para la detección de VPH La toma de muestra se obtiene de la región exoendocervical con cepillos especiales. Se transporta al laboratorio en medio líquido (la muestra puede ser viable dos semanas a temperatura ambiente aunque es conveniente refrigerarla). Puede utilizarse el mismo medio empleado en la citología líquida. Los estudios de toma por el propio paciente han demostrado su eficacia.

HC 2 Límite de detección: 4000– 5000 HPV copies Denature nucleic acids RNA: DNA complex antibodies Hybridize target DNA with RNA probe Capture RNA: DNA hybrids onto microtiter plate Chemiluminescent signal amplification Reagent reversal modification

Tipos de VPH identificados en HC 2 La prueba de captura híbrida utiliza dos mezclas de sondas de RNA para diferenciar entre tipos de VPH oncogenicos y de bajo riesgo Bajo riesgo 6, 11, 42, 43, 44 Alto riesgo 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68

PCR La amplificación de la secuencia blanco es exponencial

PCR / PRIMERS CONSENSO SOBRE EL GEN L 1 5’ 3’ MY 11/09450 pb 150 pb 65 pb GP 5/6+ SPF 1/2 L 1 C 1/2 Secuenciación de Productos de PC Bla st

Métodos de genotipificación por PCR No todos los sistemas de tipificación brindan los mismos resultados. . . - La estandarización es crítica Cada sistema de primers bien validado sufre de problemas de sensibilidad para algunos tipos virales. MY 09/11: 26, 35, 45, 52, 55, 59, 68, 73, 83 PGMY 09/11: 31, 52 GP 5+/6+: 53, 61 SPF 10: 42, 56, 59

Detección de infecciones múltiples LBA (Roche) Reference line High beta-globin Low beta-globin Note: Research array depicted. The commercial array will have differences in probe composition and configuration from research prototype

E 6 Nested Multiplex PCR PRIMERS GENERALES E 6 -E 7 16 18 45 16 45 18 (602 -666 pb) 31 PRIMERS ESPECÍFICOS COCKTAIL 1 16, 18, 31, 59, 4 5 (151 -457 pb) COCKTAIL 3 COCKTAIL 2 33, 6/11, 58, 52, 56 35, 42, 43, 44 (163 -358 pb) (181 -398 pb) COCKTAIL 4 68, 39, 51, 66 (172 -333 pb) Sotlar K. et al. J. Clin. Microbiol. 2004. 42: 3176 -84.

Recomendaciones para el manejo del paciente con criterio de positividad a VPH Massad LS et al. J Low Genit Tract Dis. 2013 17: S 1 -S 27. Guías clínicas ASCCP 2006

Detección de VPH en mujeres > 30 años Tamizaje con VPH y PAP Si cualquiera de las pruebas es positiva, seguir la estrategia normal del flujograma de ascus y continuar con el tamizaje anual. Si ambas pruebas son negativas, extender el intervalo de tamizaje hasta 3 años. Massad LS et al. J Low Genit Tract Dis. 2013 17: S 1 -S 27. Guías clínicas ASCCP 2006.

Prueba de DNA de VPH: Se requiere genotipificar?

Tipificación de VPH • Tipo: > 10% diferencias en genoma • Subtipo: Diferencias del 10 a 2 % • Variante: < 2 % en secuencias codificantes (E 6, E 7, L 1) < 5% en secuencias no codificantes (LCR) • 160 tipos de VPH se han clasificado de acuerdo a su nicho ecológico, potencial oncogénico y posición filogenética Burk RD, et al. Virology 2013; 445: 232– 43.

Usos potenciales Investigación Prueba de curación Definir persistencia para manejo de citología normal en mujeres VPH positivas Vigilancia en poblaciones vacunadas

Investigación La ausencia de tipificación en estudios epidemiológicos asume igualdad en el espectro de genotipos de VPH: Ya demostrado que hay diferencias en potencial oncogénico. Entre los tipos oncogénicos – existen diferentes riesgos de progresión o persistencia?

. . . . Carrillo García A, et al. Gynecol Oncol 2014; 134 -539.

Carrillo García A, et al. Gynecol Oncol 2014; 134 -539.

ASOCIACION ENTRE TIPO DE MUESTRA (CA+LIEAG VS LIEBG) Y COMBINACION DE VPH ENTRE TODAS LAS MUESTRAS POSITIVAS Carrillo García A, et al. Gynecol Oncol 2014; 134 -539.

Prueba de curación Confirmación de que la lesión asociada a la infección por VPH ha sido erradicada por terapia excisional, vacuna profiláctica, quimioterapia (enfermedad residual).

Vigilancia en poblaciones vacunadas Genotipificación en programas de tamizaje seleccionados pre- y post- vacunación. Monitoreo del decremento temporal anticipado en la prevalencia de VPH 16/18 Monitoreo en el incremento potencial de otros genotipos virales. Evaluación de la protección cruzada potencial de la vacuna.

Expresión de VPH en la progresión neoplásica

Detección de m. RNA de VPH ØEl VPH que se está transcribiendo (producción de m. RNA viral) asegura que la infección es activa. ØEn particular, la expresión abundante de m. RNA de E 6 y E 7 habla de una infección con alto riesgo de transformación. ØVs la detección de DNA, tiene un mayor valor predictivo positivo.

Comparación entre diferentes métodos comerciales de detección de VPH Método Paciente Detecta persistencia Principio Muestra infec. activa No Evita seg. innecesario Detecta Genotip. DNA/m. RNA VPH CH 2 No No DNA LBA Sí No No DNA Si Pre. Tect HPV-proofer Sí Sí Sí m. RNA Sí No

Debido a la sensibilidad de las pruebas moleculares la detección de DNA de VPH no necesariamente va acompañado del desarrollo de un proceso tumoral, por lo que otros pruebas podrían requerirse: 1) Citología 2) Genotipificación 3) Expresión de m. RNA de VPH 4) Integración de DNA viral 5) Estatus de p 16 y otros marcadores celulares 6) Carga viral de VPH

Vacunas vs. VPH

Los Papilomavirus codifican 2 proteinas estructurales Dos proteinas estructurales: L 1: Cada partícula tiene 360 copias. L 2: Cada partícula tiene 12 copias. La proteina L 1 se autoensambla de forma tridimensional formando “viriones” vacíos denominados “virus-like particles (VLPs)” Doug Lowy (NCI, USA)

Vacunas profilácticas vs VPH Pr L 1 L 2 Vector de Expresión o baculovirus L 1 VLPs (Virus-Like particles) L 2 Expresión y ensamblaje de L 1 y L 2 en células de levadura o de insecto

VLPs (Virus Like Particles)

Partículas virales VLP Ø No contienen DNA viral Ø Inducen anticuerpos neutralizantes contra tipos específicos. Ø Tienen efecto protector en conejos y perros, cuando se administran previamente al reto con papilomavirus de conejo y oral canino. Breitburd et al. 1995 J Virol 69: 3959. Suzich et al. 1995 PNAS 92: 11553.

(VLPs) específicas para diferentes tipos de VPH Vacunación con HPV-L 1 -VLPs DNA que codifica VPH-L 1 Inducción de anticuerpos neutralizantes Autoensamblaje de VLPs Proteína L 1 Transferencia génica y expresión en modelo de levadura VPH de alto riesgo Purificación J. Clin. Invest. 2004; 114 (4): 450– 462

Desarrollo de vacuna contra VPH Más de 25 años. . . 2006 Registro 2002 Estudios fase III - tetravalente 2002 Estudios fase II – monovalente y tetravalente 2001 Estudios fase I - monovalente 1997 Estudios Pre-clínicos: VLP induce respuesta de Ig neutralizante 1995 Agencia Internacional de Investigación en Cáncer declara a VPH tipos 16 y 18 como carcinógenos VPH involucrado en transformación celular maligna 1991 Partículas similares a virus (VLP) ensambladas en levadura y células de insecto 1990 s Primeros intentos DNA desnudo - vaccinia virus - proteínas de fusión Autoensamblaje de proteinas de cápside L 1 y L 2 1980 s Sospecha Correlación VPH – CACU Annu Rev Med 2004; 55: 319 -31 N Engl J Med 2002 ; 347(21): 1703 -1705

Eficacia de la Vacuna Cuadrivalente VPH 6, 11, 16 y 18 FUTURE II – Resultados Análisis N Engl J Med 2007; 356: 1915 -27 Punto Final Vacuna VPH Placebo Eficacia (95% IC) # de Mujeres # de Casos # de Mujeres (Tasa**) # de Casos (Tasa PP NIC 2/3, AIS* y Cáncer Relacionado a VPH-16 y 18 5, 305 1 (<0. 1) 5, 260 42 (0. 3) 98 % IT NIC 2/3, AIS* y Cáncer Relacionado a VPH-16 y 18 6, 087 83 (0. 5) 6, 080 148 (0. 8) 44 % IT NIC 2/3, AIS* y Cáncer Relacionado a cualquier tipo de VPH 6, 087 219 (1. 3) 6, 080 266 1. 5 17%

Transudación o exudación de anticuerpos séricos al sitio de la infección por VPH Schwarz TF, Oberdan L. Gynecol Oncol. 2008; 110: S 1 -S 8

Títulos de anticuerpos anti-VPH 18 inducidos por las vacunas Las pruebas clínicas muestran que la protección continúa. Se desconoce cuales son los niveles mínimos de anticuerpos anti-VPH 16 y 18 para proteger contra la enf. clínica Harper D. Prophylactic HPV vaccines: Current knowledge of impact on gynecologic premalignancies. Discovery Medicine July 2010.

Desarrollo de NICs I AIS relacionados con HP 6, 11, 16, 18 en población vacunada (Gardasil) Posible generacion de Celulas B de memoria Joura EA, et al. Vaccine 2008, 26: 6844

Modelo de estimación del impacto clínico de la vacuna profiláctica HPV-16/18 Sin Vacunación 120 Incidencia de Ca de cérvix Por 100, 000 mujeres 50% 100 80 60 40 20 75% V A C U N A C I O N 98% 0 66 62 58 54 50 46 42 38 34 30 26 22 18 14 EDAD (AÑOS) Goldie S et al. 2003 Int J Cancer 106: 893.

Tipos de VPH: 16, 18, 31, 33 , 45, 52, 58 6, 11