STERILIZZAZIONE COL CALORE Metodi di sterilizzazione Sterilizzazione con

STERILIZZAZIONE COL CALORE

Metodi di sterilizzazione Sterilizzazione con il calore: calore un metodo comune per l’uccisione dei microrganismi è l’uso del calore, che distrugge le cellule viventi attraverso la coagulazione delle proteine. La sterilizzazione può avvenire per azione del calore secco (in stufa) o del calore con vapore (in autoclave). In entrambi questi processi, la durata del riscaldamento va sempre riferita al tempo durante il quale tutto il materiale resta alla temperatura desiderata. Di qui la necessità di conoscere l’andamento della temperatura, nell’interno degli apparecchi utilizzati, per tutto il tempo del trattamento. In un diagramma tempotemperatura si notano, infatti, quattro fasi: • una che corrisponde al tempo necessario perché all’interno vi sia la temperatura di sterilizzazione; • una seconda fase che corrisponde al tempo necessario perché il materiale da sterilizzare raggiunga questa temperatura (tempo di latenza); • una terza fase durante la quale il materiale resta alla temperatura di sterilizzazione; • infine una quarta fase corrispondente al tempo di raffreddamento.

Andamento della temperatura in un recipiente durante la sterilizzazione

FATTORI CHE INFLUENZANO LA STERILIZZAZIONE temperatura tempo tipo di calore: secco o umido stato del microorganismo: spora o vegetativo condizioni ambientali.

Numerosi fattori influiscono sulla resistenza delle cellule microbiche ai trattamenti termici e, tra questi, la specie di apparteneza e le condizioni ambientali. Specie microbica: vi sono notevoli differenze tra i vari generi, specie e ceppi. In linea generale, si può dire che i microrganismi più sensibili sono i batteri non sporigeni, i virus grandi, le muffe e i lieviti. Più resistenti sono i virus piccoli (virus dell’epatite o della poliomelite, ad esempio). Per una determinata specie le spore sono più resistenti delle forme vegetative. Per questa ragione, la F. U. impiega le spore di varie specie batteriche per controllare l’efficacia dei metodi distruttivi di sterilizzazione. Ambiente nel quale si trovano i germi: la resistenza dei germi ai trattamenti termici è fortemente influenzata dall’ambiente nel quale i germi si trovano e, in definitiva, dal materiale che deve essere sterilizzato. La presenza o l’assenza di acqua, il tenore in umidità svolgono un ruolo molto importante: ad esempio le spore del tetano sono distrutte in 15 min. a 120°C in ambiente umido, mentre in ambiente secco occorrono tre ore a 150 -160°C. Altri elementi importanti sono il p. H dell’ambiente e la presenza di terreni particolarmente favorevoli allo sviluppo microbico. Per quanto riguarda il p. H la maggior parte dei batteri patogeni ha l’optimum vitale a p. H 7, 0; vi sono però microrganismi che si moltiplicano a p. H leggermente alcalino ed altri per i quali l’ambiente favorevole è a p. H acido.

RAPPORTO TEMPERATURA / TEMPO DI DISTRUZIONE Thermal Death Time: tempo necessario per sterilizzare ad una data temperatura. A parità del bioburden, aumentando la temperatura si diminuisce il tempo di trattamento termico.

1. CALORE UMIDO

TIPI DI VAPORE Vapore saturo Ø possiede il massimo calore latente di vaporizzazione Ø ottima distribuibilità e penetrazione. Vapore umido Ø possiede minor calore latente di vaporizzazione. Vapore surriscaldato Ø poco efficiente Ø difficile calcolare il contributo calorico perché c’è la componente di surriscaldamento non umida.

Sterilizzazione a calore umido con vapore saturo: il calore umido è più efficace rispetto al calore secco nell’inattivare i microrganismi, in quanto trasportando una quantità di energia molto maggiore, provoca facilmente la coagulazione delle proteine cellulari e dei microrganismi presenti. Infatti il vapore, oltre ad avere una capacità termica maggiore rispetto a quella dell’aria, condensando libera una quantità di energia termica pari al suo calore latente di vaporizzazione, che è di oltre 500 calorie per grammo. Di contro, la quantità di energia termica ceduta dall’aria secca, non soggetta ad un passaggio di stato, è uguale solo a 1 caloria per grammo di aria per ciascun grado di raffreddamento. Di conseguenza un oggetto si riscalderà molto più rapidamente se colpito da vapore. Per ottenere una sufficiente sicurezza, la Farmacopea e le GMP indicano come condizione di riferimento per le preparazioni acquose, la temperatura di 120°C e un tempo di almeno 15 minuti. In generale la sterilizzazione al calore umido richiede una temperatura di 121°C e un tempo di azione a tale temperatura di almeno 20 minuti.

LE AUTOCLAVI • Le autoclavi sono recipienti in acciaio inossidabile, con base inclinata per lo scarico delle condense a pareti robuste, spesso parete doppie, angoli interni arrotondati, con coperchio a chiusura ermetica, a tenuta di pressione e di vuoto, muniti di valvola di sicurezza e di sfiato del vapore, dell’aria o del gas. La camera dove avviene la sterilizzazione dei prodotti è circondata da una intercapedine dove è introdotto il vapore per il riscaldamento dell’autoclave stessa Le autoclavi sono costruite completamente in acciaio inox AISI 304 o 316

VAPORE SATURO SOTTO PRESSIONE La pressione, superiore a quella atmosferica è necessaria raggiungere la temperatura per di sterilizzazione che è 121°C per 20 minuti Il vapore, che può essere prelevato dalla rete aziendale o prodotto in una apposita caldaia collegata con l’apparecchiatura, viene convogliato nell’intercapedine e nella camera di sterilizzazione tramite una stessa conduttura o per mezzo di altre non comunicanti tra loro in modo da rendere indipendenti le due zone di riscaldamento.

RELAZIONE PRESSIONE/VAPORE La pressione, superiore a quella atmosferica, è necessaria per raggiungere la temperatura di sterilizzazione.

ELIMINAZIONE DELL’ARIA Per la riuscita del processo di sterilizzazione è di primaria importanza che l’aria presente venga scacciata completamente dal vapore. Infatti, in presenza di aria il riscaldamento avviene più lentamente e le temperature che si raggiungono sono inferiori. Relazione temperatura/tempo con aria totalmente o parzialmente eliminata A: aria completamente eliminata B: 1/2 aria eliminata C: 1/3 aria eliminata D: Senza eliminazione aria IMPORTANTE L’aria (a parità di condizioni di temperatura e pressione) ha densità circa 1. 6 volte maggiore del vapore e tende a stratificarsi sul fondo della camera o rimanere intrappolata nel carico generando intollerabili gradienti negativi di temperature (sacche d’aria).

• Generalmente le autoclavi sono dotate di due dispositivi di sicurezza: uno meccanico che impedisce l’apertura della porta se nella camera c’è pressione, l’altro elettrico che blocca l’inizio della sterilizzazione a camera aperta. • Tutte le autoclavi sono dotate di pompe a vuoto collegate a valvole pneumatiche servono ad aspirare il contenuto d’aria, gas o vapore presente all’interno dell’autoclave. • Il ripristino della pressione atmosferica viene effettuata immettendo aria opportunamente filtrata.

Ø L’aria viene evacuata dalla parte inferiore frontale dell’autoclave attraverso una valvola che resta aperta finché non viene raggiunta la temperatura predefinita. Ø Un grosso problema è la possibilità che aria resti intrappolata in contenitori chiusi o stretti o mal disposti, oppure nello spazio fra i contenitori stessi, se l’autoclave è stata eccessivamente caricata. Ø Se l'aria non viene completamente evacuata, in quelle parti la temperatura rimane inferiore a quella necessaria alla sterilizzazione.

Il vapore deve penetrare ogni fibra e deve giungere su ogni superficie del materiale da sterilizzare. Quando il vapore sotto pressione entra nella camera di sterilizzazione, condensa a contatto con il materiale freddo. Questa condensazione libera calore, così scaldando e simultaneamente bagnando tutto il carico, rispondendo così ai due requisiti: umidità e calore. Al punto di rugiada, il vapore saturo condensa liberando circa 540 cal/g: questa energia è 500 volte maggiore di quella fornita da un ugual peso di aria calda secca.

Eliminazione dell’aria Tutte le moderne autoclavi sono dotate di pompe da vuoto ad anello d’acqua, ma esse non sono in grado di produrre in camera un vuoto migliore di 60 -80 mbar residui: ciò significa che circa il 6 -8% dell’aria inizialmente presente rimane in camera e ciò non è tollerabile ai fini della sterilizzazione. Per eliminarla si utilizzano due espedienti: a. Vuoto pulsato o frazionato: raggiunto il vuoto limite della pompa si ferma l’aspirazione, e si immette in camera vapore più o meno fino alla pressione atmosferica (0. 5 - 1 atm), quindi si ripete la precedente fase di vuoto. Ripetendo queste pulsazioni vuoto/vapore 3 o più volte si riesce ad eliminare completamente l’aria dalla camera di carico. b. Vuoto dinamico: raggiunto il vuoto limite si mantiene completamente l’aspirazione della pompa, ma contemporaneamente si effettua in camera un’iniezione di vapore per alcuni minuti (l’orifizio di ingresso vapore deve essere al capo opposto della camera rispetto all’orifizio di vuoto). Il risultato è analogo a quello del vuoto pulsato. E’ indispensabile che il vapore sia privo dei cosiddetti gas non condensabili (NCG) che sono abitualmente costituiti da CO 2 derivante dal fatto che l’acqua utilizzata per produrre il vapore non è stata degasata a dovere. La CO 2 comporta i medesimi inconvenienti dell’aria residua in camera, anzi maggiori perché è più densa dell’aria.

- METODO DELL’ALTO VUOTO Ø Si fa il vuoto nella camera prima di introdurre il vapore e alla fine del trattamento per reintrodurre aria sterile. E’ IL METODO PIU’ EFFICIENTE.

Ø L’aria viene rimossa con una pompa da vuoto mentre contemporaneamente viene immesso vapore saturo sotto pressione. Ø Il vapore in pressione entra dalla parte posteriore dell’autoclave e colpisce uno spandivapore (baffle). Ø Pressione e temperatura crescono mano che entra il vapore. Ø L’aria fluisce verso l’uscita sia perché aspirata dalla pompa, sia perché spinta dal vapore, sia per gravità. Ø Un termometro all’uscita dall’autoclave indica quando si è arrivati alla temperatura prefissata e quindi non c’è più aria presente.

- METODO DEL VUOTO PULSANTE Ø Questo metodo è meno efficiente di un ciclo di alto vuoto ma più efficiente di un ciclo standard per gravità. Questo metodo è applicato sopratutto nelle autoclavi di tipo ospedaliero

FASI E CICLO TEMPORALE Ø 1^ FASE: ELIMINAZIONE DELL’ARIA Ø 2^ FASE: RISCALDAMENTO tempo di riscaldamento fino alla isoterma, comprensivo del tempo di latenza Ø 3^ FASE: STERILIZZAZIONE isoterma di sterilizzazione Ø 4^ FASE: RAFFREDDAMENTO tempo di raffreddamento (accorciabile nebulizzando acqua sterile fredda oppure usando camicie raffreddanti).

ABACO DELLA STERILIZZAZIONE materiale 3 autoclave 2 1 Bisogna lasciare al materiale da sterilizzare il tempo per raggiungere la temperatura di trattamento: il tempo di sterilizzazione va calcolato solo dopo che il materiale ha raggiunto la temperatura prefissata.

Negli incubatori ad impiego industriale le temperature interne, data la mole delle apparecchiature sono misurate attraverso termosensori posti in differenti punti dell’autoclave. Per le preparazioni acquose la Farmacopea Europea suggerisce come condizioni di riferimento un ciclo di sterilizzazione in autoclave , a una temperatura minima di 121°C per un tempo di 15 minuti. A questo periodo si dovrà aggiungere il tempo necessario perché tutto il materiale da sterilizzare raggiunga la temperatura prevista e quello per il raffreddamento. La definizione del tempo di sterilizzazione è importante per evitare non solo il mancato raggiungimento della sterilità, ma anche eccessivi prolungamenti di esposizione al calore del principio attivo e dei contenitori Possono essere efficacemente trattate in autoclave le preparazioni farmaceutiche acquose che devono essere sterilizzate in contenitori sigillati (sterilizzazione terminale), mentre per preparazioni farmaceutiche non acquose i contenitori sigillati non potranno essere sterilizzati con lo stesso metodo in quanto non contenendo acqua non possono generare vapore. Se gli involucri che contengono il materiale da trattare con calore umido non sono sigillati, devono permettere una facile penetrazione del vapore caldo e la fuoriuscita di aria; inoltre devono essere adeguati a sopportare alte temperature senza dar luogo a deformazioni consistenti.

RELAZIONE TEMPERATURA-TEMPO F 0(121) = tempo di letalità: è il tempo rapportato a 121°C necessario letalità per garantire la sterilità. F 0(t) = tempo di permanenza a “quella” temperatura Z = la variazione di temperatura, espressa in Celsius, necessaria per aumentare di 10 volte la velocità di distruzione del microorganismo (F o D). Nella “steam sterilizzation” Z = 10.

TRATTAMENTI • Le autoclavi industriali possono eseguire numerosi programmi fra cui: Ø sterilizzazione di soluzioni infialate; Ø sterilizzazione di siringhe e aghi ipodermici anche già confezionati; Ø trattamento integrale dei tappi con lavaggio, risciacquo, siliconatura, sterilizzazione e asciugatura spinta.

MECCANISMO DI AZIONE Ø La morte del microorganismo è causata: ü dalla denaturazione delle proteine, ü dalla coagulazione delle proteine, ü dal collasso del sistema enzima-proteina all'interno delle cellule. Queste interazioni sono favorite dalla presenza di acqua.

MONITORING

PRO E CONTRO DEL METODO PRO: PRO v Molto efficace v Distruzione delle spore in tempi ragionevolmente brevi v Facile controllo del processo v Nessun residuo (tantomeno tossico) dal trattamento v Poco costoso. CONTRO: CONTRO v Non usabile per materiali sensibili a quelle condizioni operative.

2. CALORE SECCO q Il calore secco è meno efficace del calore umido perché non contiene calore latente di vaporizzazione. q Richiede tempi e/o temperature maggiori. q E’ utilizzabile solo su materiali inerti non termolabili.

Attrezzatura : stufa o forno (discontinuo ) tunnel (continuo) Applicazioni: fiale flaconi vetreria materiali termostabili.

STUFE O FORNI acciaio inox AISI 304

CONDIZIONI DI TRATTAMENTO 170 gradi - 1 ora 160 gradi - 2 ore 150 gradi - 2. 5 ore 140 gradi – 3 ore Ø I controlli di sterilità sono eseguiti con il LAL Test. q Il termometro del forno misura solamente la temperatura del forno, non la temperatura del materiale. q Termocoppie e pirometri opportunamente posizionati sono indispensabili per monitorare la temperatura del materiale.

1 - FORNI A CONVEZIONE PER GRAVITÀ NON HANNO VENTILATORI 2 - FORNI A CONVEZIONE MECCANICI CIRCOLAZIONE D’ARIA FORZATA DA UNA VENTOLA

TUNNELS CONTINUI q Il materiale viene trasportato su un nastro a rete in acciaio inox. q Incontra una zona di sbarramento di aria a flusso laminare in entrata (preriscaldata) e in uscita così da isolare il tunnel creando una leggera sovrapressione rispetto all’ambiente di alimentazione, impedendo così la penetrazione di aria contaminata q Nella zona di sterilizzazione viene immessa aria filtrata a flusso laminare classe 100 così da creare una sovrapressione in presenza di fonti di calore. q Segue una zona di raffreddamento per un graduale abbassamento della temperatura fino a temperatura ambiente.

MECCANISMO DI AZIONE Ø Germi e spore sono in genere più resistenti al calor secco che al calor umido. Ø Ciò è dovuto all'indurimento degli strati esterni delle cellule batteriche conseguente al denaturazione delle proteine causata dal calore secco: l'indurimento rallenta la velocità di trasferimento del calore verso l'interno della cellula batterica. Ø L'effetto letale del calore secco si ritiene sia dovuto sia a coagulazione di proteine interne sia a processi ossidativi.

PROBLEMI Ø La distribuzione del calore sulla superficie intera del materiale avviene piuttosto lentamente. Ø La formazione di tasche fredde riduce l'affidabilità della procedura. Ø La preparazione e la disposizione del materiale da sterilizzare influenzano molto l'efficacia della procedura. Ø Non è possibile una convalida della procedura. Ø Anche quando la camera è caricata correttamente, questo metodo non è affidabile a meno che non si lavori ad abundantiam (elevate temperature per lungo tempo).

PRO E CONTRO DEL METODO VANTAGGI Ø semplicità Ø mancanza di residui tossici (compresi i pirogeni) Ø adatto per prodotti termostabili Ø non ha effetti corrosivi Ø minimo effetto di arrugginimento. SVANTAGGI Ø alte temperature Ø lunghi tempi di esposizione (azione lenta) Ø importanza del caricamento Ø il calore penetra lentamente e in modo disuguale Ø inadatto per materiali termolabili.

MONITORING

LAL TEST • Si usa un aracnide di origine antica, il Limulus Polyphemus, che vive nei mari vicino alle coste del Nord America. • Il suo sangue (emolinfa) contiene un unico tipo di cellule, amebociti, il cui lisato si agglutina rapidamente (gel solido) a contatto con endotossine (lipopolisaccaridi) batteriche.

TANTO PER SAPERLO ……

TINDALIZZAZIONE METODO DEL RISCALDAMENTO FRAZIONATO Si operano 3 -5 riscaldamenti fra 60 -80°C, ognuno della durata di 1 ora, separati da un periodo di riposo di 24 ore a temperatura ambiente. TEORIA (? ? ): le forme vegetative vengono distrutte a 60 -80°C. Nelle 24 ore di TEORIA intervallo, eventuali spore evolverebbero a forma vegetativa per venir distrutte con i successivi riscaldamenti. Teoria discutibile: le spore evolvono alla forma vegetativa solo in condizioni ottimali. Il processo è utilizzabile solo in casi particolari, per materiali molto sensibili al calore, poco inquinati per conto loro e che vengono prodotti già in condizioni di asepsi.

PASTORIZZAZIONE Pastorizzazione stata chiamato il processo sviluppato da Pasteur per prevenire il deterioramento del vino. È importante notare che pastorizzazione non è sinonimo di sterilizzazione: lo scopo è ridurre la popolazione batterica ed uccidere i patogeni. Questo processo usa il calore per distruggere i patogeni e ridurre il numero di microbi che causano deterioramento dei cibi. La pasteurizzazione si basa sul concetto di trattamento equivalente: al crescere della temperatura è richiesto un minor tempo per uccidere i microorganismi.

q Holding method LTLT: 62. 9°C for 30 min. LTLT q Flash method HTST: 71. 6°C for 15 sec. HTST q Ultrapasteurization: 82°C for 3 sec. q Ultra-high temperature UHT: 140°C for 3 sec. UHT