LA DUPLICAZIONE DEL DNA Indice quando si verifica

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LA DUPLICAZIONE DEL DNA

LA DUPLICAZIONE DEL DNA

Indice • • quando si verifica Acidi nucleici: struttura Aspetti storici Meccanica del processo

Indice • • quando si verifica Acidi nucleici: struttura Aspetti storici Meccanica del processo

Quando

Quando

Cromosomi eucarioti

Cromosomi eucarioti

Gli acidi nucleici Acidi nucleici

Gli acidi nucleici Acidi nucleici

Struttura generale degli acidi nucleici - Polimeri di nucleotidi - Nucleotidi: zucchero pentoso gruppo

Struttura generale degli acidi nucleici - Polimeri di nucleotidi - Nucleotidi: zucchero pentoso gruppo fosfato base azotata

I diversi pentosi desossiribosio

I diversi pentosi desossiribosio

Le diverse basi azotate

Le diverse basi azotate

Caratteristiche dei nucleotidi dei due acidi nucleici: DNA: * pentoso: * basi azotate: desossiribosio

Caratteristiche dei nucleotidi dei due acidi nucleici: DNA: * pentoso: * basi azotate: desossiribosio A, T, C, G RNA: * pentoso: * basi azotate: ribosio A, U, C, G

I nucleotidi - numerazione (1’, 3’, 5’) - legami

I nucleotidi - numerazione (1’, 3’, 5’) - legami

I polimeri

I polimeri

Coinvolgimento di gruppo fosfato legato al carbonio 5’ del pentoso gruppo ossidrile legato al

Coinvolgimento di gruppo fosfato legato al carbonio 5’ del pentoso gruppo ossidrile legato al carbonio 3’

Le catene polipeptidiche presentano due estremità diverse - Terminale o estremità 5’ - Terminale

Le catene polipeptidiche presentano due estremità diverse - Terminale o estremità 5’ - Terminale o estremità 3’ Hanno doppia polarità Come interpretare la sequenza ACG?

Struttura del DNA Modello di Watson e Crick (Nature, 1953)

Struttura del DNA Modello di Watson e Crick (Nature, 1953)

Caratteristiche Modello DNA: • 2 catene di nucleotidi Legami tra nucleotidi? • eliche arrotolate

Caratteristiche Modello DNA: • 2 catene di nucleotidi Legami tra nucleotidi? • eliche arrotolate attorno ad un unico asse • Basi azotate si trovano all’interno, i gruppi fosfati e gli zuccheri si trovano all’esterno • Ogni base di un elica è appaiata con una base complementare dell’altra elica: – A con T G con C – legami tra basi complementari? A con T --G con C --- – Ogni coppia: 2 legami H 3 legami H • PURINA con PIRIMIDINA • diametro della doppia elica è di 2 nm • I filamenti sono ANTIPARALLELI – Le eliche hanno una POLARITÀ: estremità 3’-OH e 5’- OH – le due eliche hanno direzioni opposte

Altre proprietà chiave nel modello Watson-Crick • Distanza tra coppie di basi = 0.

Altre proprietà chiave nel modello Watson-Crick • Distanza tra coppie di basi = 0. 34 nm • Diametro della doppia elica = 2 nm • 10 basi per “giro” dell’elica • Si possono distinguere due solchi (maggiore, minore) dovuti al fatto che i due filamenti non hanno sempre la stessa distanza dall’asse dell’elica • Basi possono essere raggiunte da proteine a livello di zone esposte chiamate “solchi” • L’elica è destrorsa

Aspetti storici: Aspetti storici

Aspetti storici: Aspetti storici

1) Modello della replicazione semiconservativa: DNA figlio contiene un filamento parentale e uno neosintetizzato.

1) Modello della replicazione semiconservativa: DNA figlio contiene un filamento parentale e uno neosintetizzato. 2) Modello a replicazione conservativa: Una molecola di DNA formata da catene neosintetizzate e l’altra da due catene parentali. 3) Modello a replicazione dispersiva: DNA nuovo e vecchio a mosaico nel DNA neosintetizzato.

Meselson e Stahl, 1958 Modello della replicazione semiconservativa

Meselson e Stahl, 1958 Modello della replicazione semiconservativa

Meccanica della replicazione del DNA La replicazione è semiconservativa

Meccanica della replicazione del DNA La replicazione è semiconservativa

Dove inizia? Come si verifica? Quali molecole sono coinvolte?

Dove inizia? Come si verifica? Quali molecole sono coinvolte?

Inizio della replicazione Doppia elica deve essere svolta Svolgimento iniziale avviene in una regione

Inizio della replicazione Doppia elica deve essere svolta Svolgimento iniziale avviene in una regione del genoma chiamata “origine” o “ori” Sequenze scoperte nei procarioti da John Cairns (1963)

Nei procarioti

Nei procarioti

Direzione di sintesi

Direzione di sintesi

Eucarioti DNA lineare, più molecole Cromosomi presentano molte zone “origine” o “ori”

Eucarioti DNA lineare, più molecole Cromosomi presentano molte zone “origine” o “ori”

 numerose origini di replicazione in contemporanea

numerose origini di replicazione in contemporanea

Cromosoma batterico: 4, 2. 106 bp 1 origine di replicazione Velocità di replicazione: 5.

Cromosoma batterico: 4, 2. 106 bp 1 origine di replicazione Velocità di replicazione: 5. 104 bp/min Genoma Uomo: 3 x 109 bp più origini di replicazione in un cromosoma ( 1 replicone ogni 20 -300. 103 bp) Velocità di replicazione: 500 -5’ 000 bp/min

Le proteine coinvolte

Le proteine coinvolte

Elicasi ha il compito di aprire la doppia elica parentale Dove? Come?

Elicasi ha il compito di aprire la doppia elica parentale Dove? Come?

DNA ELICASI SI LEGA AL DNA SEPARA LA DOPPIA ELICA IL MOVIMENTO DELL’ELICASI RICHIEDE

DNA ELICASI SI LEGA AL DNA SEPARA LA DOPPIA ELICA IL MOVIMENTO DELL’ELICASI RICHIEDE IDROLISI DI ATP

Problema

Problema

Problema Tensioni possono impedire l'ulteriore svolgimento.

Problema Tensioni possono impedire l'ulteriore svolgimento.

Topoisomerasi (ad es girasi) Taglia un filamento di DNA, subito dopo la forcella di

Topoisomerasi (ad es girasi) Taglia un filamento di DNA, subito dopo la forcella di duplicazione Permette rotazione per allentare l'elica Determina ricongiungimento dei filamenti

Topoisomerasi tipo II

Topoisomerasi tipo II

Problema

Problema

Problema

Problema

Proteine stabilizzanti il filamento singolo Si legano temporaneamente al filamento di DNA per impedirne

Proteine stabilizzanti il filamento singolo Si legano temporaneamente al filamento di DNA per impedirne il riavvolgimento

Primasi Produce corte sequenze di RNA Sequenze=primer o innesco

Primasi Produce corte sequenze di RNA Sequenze=primer o innesco

Polimerasi • Polimerizza nuovo DNA • Non è in grado di iniziare una nuova

Polimerasi • Polimerizza nuovo DNA • Non è in grado di iniziare una nuova catena di nucleotidi su di un filamento stampo • Può solo addizionare Nu all’estremità di un filamento già esistente appaiato allo stampo • Occorre? Breve sequenza di Nu (ca. 10 Nu) già appaiati a filamento stampo PRIMER o INNESCO

Problema?

Problema?

La primasi lega i nucleotidi di RNA dell’innesco La DNA polimerasi aggiunge nucleotidi di

La primasi lega i nucleotidi di RNA dell’innesco La DNA polimerasi aggiunge nucleotidi di DNA all’innesco Una DNA polimerasi diversa (DNA polimerasi I) sostituisce l’RNA con il DNA. Il filamento è adesso completato

Polimerasi

Polimerasi

Problema: Duplicazione deve avvenire per i due filamenti con orientamento opposto. Come è possibile?

Problema: Duplicazione deve avvenire per i due filamenti con orientamento opposto. Come è possibile?

Esercizio Rappresenta la sintesi di DNA partendo da una doppia elica 1. Richiama le

Esercizio Rappresenta la sintesi di DNA partendo da una doppia elica 1. Richiama le proteine coinvolte (nomi e ruoli) 2. Evidenzia l’orientamento di tutti i filamenti rappresentati 3. Rappresenta il lavoro della polimerasi alle forcelle considerando le sue caratteristiche

Conclusioni

Conclusioni

Animazioni duplicazione • Mcgraw Hill: How nucleotides are added in DNA replication http: //highered.

Animazioni duplicazione • Mcgraw Hill: How nucleotides are added in DNA replication http: //highered. mheducation. com/olcweb/cgi/pluginpop. cgi? it=swf: : 535: : /sites/dl/free/0072437316/120076/ bio 23. swf: : How%20 Nucleotides%20 are%20 Added%20 in %20 DNA%20 Replication • Mc Graw Hill: DNA Replication Fork http: //highered. mheducation. com/olcweb/cgi/pluginpop. cgi? it=swf: : 535: : /sites/dl/free/0072437316/120076/ micro 04. swf: : DNA%20 Replication%20 Fork

Approfondimenti

Approfondimenti

Le polimerasi

Le polimerasi

Le polimerasi nei procarioti Enzima Funzione Attività esonucleasica DNA polimerasi I Riparazione del DNA

Le polimerasi nei procarioti Enzima Funzione Attività esonucleasica DNA polimerasi I Riparazione del DNA Rimozione inneschi dei frammenti di Okazaki Duplicazione 3'-5' e 5'-3' DNA polimerasi II Riparazione del DNA 3'-5' DNA polimerasi III Principale enzima della duplicazione (F. guida e F. ritardato) complesso multimerico DNA polimerasi IV Riparazione del DNA polimerasi V Riparazione del DNA 3'-5' sintesi delle translesioni

Le polimerasi negli eucarioti Le principali Enzima DNA polimerasi α DNA polimerasi β DNA

Le polimerasi negli eucarioti Le principali Enzima DNA polimerasi α DNA polimerasi β DNA polimerasi γ DNA polimerasi δ Funzione Primo allungamento degli inneschi di RNA durante la replicazione (50 -100 Nu) Attività esonucleasica No Riparazione del DNA No Replicazione del DNA mitocondriale 3'-5' Principale enzima duplicazione Sintesi su filamento ritardato e filamento guida 3'-5' DNA polimerasi ε Replicazione del DNA, sintetizza il DNA sul filamento guida 3'-5' DNA polimerasi η Sintesi da translesione No

Come permettere la conservazione del genoma? Sistemi di riparazione: - correzione di bozze -

Come permettere la conservazione del genoma? Sistemi di riparazione: - correzione di bozze - riparazione delle anomalie di appaiamento - riparazione per escissione

Sistemi di riparazione - correzione di bozze che corregge gli errori mano a mano

Sistemi di riparazione - correzione di bozze che corregge gli errori mano a mano che la DNA polimerasi li compie 1/109 - una riparazione delle anomalie di appaiamento, che esamina il DNA subito dopo che si è duplicato e corregge gli appaiamenti sbagliati; - una riparazione per escissione che elimina le basi anomale dovute a un agente mutageno e le sostituisce con basi funzionali.

DNA lineare: la replicazione alle estremità

DNA lineare: la replicazione alle estremità

Perchè non viene riempita?

Perchè non viene riempita?

Conseguenze? • Accorciamento del cromosoma a ogni duplicazione del DNA • Va bene?

Conseguenze? • Accorciamento del cromosoma a ogni duplicazione del DNA • Va bene?

TELOMERI

TELOMERI

TELOMERI – Sequenze speciali alle estremità dei cromosomi – Non contengono geni – Sono

TELOMERI – Sequenze speciali alle estremità dei cromosomi – Non contengono geni – Sono ripetizioni multiple di una breve sequenza nucleotidica: • negli umani di 6 Nu di TTAGGG • Da 100 -1000 ripetizioni – DNA –telomerico protegge i geni dell’organismo dall’erosione

Telomeri non preservano dall’accorciamento ma rimandano il problema Con il passare dei cicli si

Telomeri non preservano dall’accorciamento ma rimandano il problema Con il passare dei cicli si accorciano i telomeri

Soluzione?

Soluzione?

Soluzione? In quali cellule è sempre attiva? • organismi unicellulari, • cellule germinali, •

Soluzione? In quali cellule è sempre attiva? • organismi unicellulari, • cellule germinali, • cellule embrionali precoci • alcune cellule somatiche (es. midollo osseo e cellule che rivestono l’intestino) • Alcune cellule tumorali!