UNIVERSIDAD NACIONAL DE QUILMES LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGIA AREA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE QUILMES LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGIA AREA: BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR ASIGNATURA: GENETICA MOLECULAR TURNO NOCHE: PROFESOR TITULAR: DR. VICTOR ROMANOWSKI PROFESOR ADJUNTO: DRA. PATRICIA AGOSTINO

BLOG: http: //genmol. blog. unq. edu. ar/

TEMAS DE LAS CLASES TEORICAS • Estructura del material genético. • Replicación del DNA. • Mutaciones y reparación del daño en el DNA. 1º PARCIAL • Recombinación. • Mecanismos de transposición. • Transcripción. • Regulación de la expresión génica. • Traducción. 2º PARCIAL • Direccionamiento de proteínas. • Técnicas corrientes en genética molecular. • DNA recombinante y estudios cromosómicos. • Organismos transgénicos y terapia génica. A LO LARGO DEL CUATRIMESTRE

Bibliografía recomendada • Biología Molecular de la célula. Alberts B. , Johnson A. , Lewis J. , Raff M. , Roberts K. , Walter P. (2002). 4º edición, Garland Publishing, Inc. Catálogo biblioteca UNQ: 571. 6 BIO (ediciones 1996, 2002 y 2004). • Biología Celular y Molecular. Lodish H, Baltimore D. , Berk A. , Zipursky S. L. , Matsudaira P. , Darnel, J. (2002). 4º edición, editorial Médica Panamericana SA, España (5º edición en inglés). Catálogo biblioteca UNQ: 571. 6 BIO (ediciones 2001 y 2005). • Gene VIII. Lewin, B. (2004). Ed. Prentice Hall. (y ediciones anteriores). Catálogo biblioteca UNQ: 572. 8 LEW (edición 1995, Gene V). • Lehninger. Principles of Biochemistry, Lehninger A. L. , Nelson D. L. , Cox M. M. (2008), 5º edición (en castellano: 3º edición, 2001, editorial Omega, España). Catálogo biblioteca UNQ: 572. 3 LEH. • Molecular Biology. Weaver, R. (2004). 4º edición, Editorial Mc. Graw-Hill.

Información actualizada y sitios de interés www. pubmed. com www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/query. fcgi? db=Books

Cronograma (primeras clases)

GENETICA MOLECULAR, LABORATORIOS Extracción de ADN de tejidos humanos Alumnos + algunos familiares por vía materna Amplificación por PCR y análisis de polimorfismos ADN nuclear Gen Amelogenina Identificación sexual Deleciones en el cromosoma Y Total: 5 trabajos prácticos ADN mitocondrial Herencia Materna

TP 1: Extracción de ADN a partir de muestras de mucosa bucal Se realizará una extracción de ADN humano para su posterior amplificación utilizando la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Los alumnos extraen su propio ADN a partir de muestras de mucosa bucal. Se suman también muestras de familiares por vía materna. Extracción con cloroformo-isoamílico. Semi-cuantificación mediante electroforesis en gel de agarosa. 2 clases

TP 2: Caracterización del sexo mediante la amplificación por PCR del gen de amelogenina. El gen de amelogenina (AMG) codifica para una proteína del esmalte dental, y se encuentra en ambos cromosomas sexuales. La secuencia de este gen en el cromosoma Y se diferencia de la del X por una deleción de aproximadamente 200 pb, por lo que la visualización del producto de PCR permitirá distinguir las muestras provenientes de mujeres de aquéllas provenientes de varones. Amplificación de AMG por PCR. Resolución en gel de agarosa 2% 2 clases

TPs 3 y 4: Detección de RFLPs (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms) mediante la amplificación por PCR de un fragmento de ADN mitocondrial. A diferencia del DNA nuclear, la herencia del DNA mitocondrial es exclusivamente materna. Esta unidad incluye la amplificación por PCR de una región del DNA mitocondrial de 312 pb (conocida como secuencia de Anderson) y su posterior digestión enzimática para poder visualizar el patrón de RFLPs característico de cada muestra. La visualización de RFLPs se realiza mediante la técnica de electroforesis en geles de arcrilamida. Amplificación por PCR fragmento ADNmit Digestión con enzima Mnl. I Visualización patrones RFLP 3 clases

TP 5: Detección de deleciones en el cromosoma Y asociadas con infertilidad masculina. Existen grandes regiones en el cromosoma Y asociadas con la producción de células espermáticas, conocidas como AZF (azoospermia factor). Deleciones en algunas de estas regiones se asocian a infertilidad masculina. Se utilizarán los conceptos aprendidos (como PCR multiplex) para el estudio de microdeleciones correspondientes a la región de los genes AZF y su correlación con infertilidad y cáncer testicular. 2 clases

FORMA DE EVALUACION Teoría: • Dos exámenes parciales y un integrador. • Se promociona con 7 (siete) o más puntos en los parciales. Trabajos prácticos: • 80% de asistencia • Informe de TPs • Exposición de trabajos • Examen de TPs REGIMEN DE ESTUDIOS DE LA UNQ http: //www. unq. edu. ar/advf/documentos/5006 e 6 bcefbf 8. pdf ARTICULO 11°: Se considerará ausente a aquel alumno que no se haya presentado a las instancias de evaluación pautadas en el Programa de la asignatura.

Clase de hoy: ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO RESUMEN DE LA CLASE Introducción sobre los siguientes temas: Primeras evidencias sobre los ácidos nucleicos. Bases, nucleósidos y nucleótidos. Estructura química y estabilidad. DNA A, B y Z. Estructura del RNA. Hidrólisis y densidad de los ácidos nucleicos. Efecto hipercrómico. Desnaturalización (térmica, por solventes y agentes caotrópicos) Avances científicos en base a la desnaturalización y renaturalización.

El dogma central de la biología molecular replicación de DNA procesamiento de RNA splicing, edición, modificación de nucleótidos y de extremos 5´y 3´ reparación recombinación transcripción inversa transcripción virus a DNA retrovirus y retroelementos RNA transcripción y replicación de RNA virus a RNA traducción proteína plegamiento (folding), procesamiento, direccionamiento (targeting) Expandiendo aun más el dogma: non-coding RNAs (micro. RNA, etc. )

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Las primeras evidencias Un poco de historia… 1928: Frederick Griffith Infección con dos cepas de Streptococcus pneumoniae Lisas (S): virulentas (S) (R) Rugosas (R): inofensivas (S) inactivada Griffith showed that adding heat-killed virulent bacteria (harmless to mice) to a live nonvirulent strain permanently transformed the latter into lethal, virulent, encapsulated bacteria. (R) + (S) inactivada

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I ¿Como se demostró que el DNA es el responsable de la herencia? El experimento de Avery O. , Mc. Leod C. y Mc. Carty M. (1944) fue la primer evidencia directa de que el DNA es la base de la información genética Extract from heated smooth (S) bacteria treatment with DNAase (digests DNA) treatment with protease (digests proteins) mix with rough (R) bacteria and injected into mice lived mice died DNA carries genetic information

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Alfred Hershey y Martha Chase (1952) Determinaron que el DNA es el material genético en el bacteriófago T 2 32 P experiment 35 S experiment

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I La naturaleza química de los ácidos nucleicos Cuando se realiza la hidrólisis completa de los ácidos nucleicos, se obtienen tres tipos de componentes principales: • Azúcar: una pentosa. • Ácido fosfórico • Bases nitrogenadas: purinas y pirimidinas A, G, T, C están presentes en el ADN A, G, U, C están presentes en el ARN

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Nomenclatura

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Bases inusuales Además de las bases nitrogenadas anteriormente descritas, se han encontrado otras bases nitrogenadas en algunos virus o formando parte de algunos tipos especiales de RNAs. Ejemplos de algunas de estas bases púricas poco corrientes son: • Hipoxantina, • Xantina, • 2 -metiladenina, • 7 -metilguanina • 6 -metil-aminopurina. Ejemplos de bases pirimidínicas: • 5 -metilcitosina (propia del DNA) • 5 -hidroximetil citosina (HMC): sustituye a la citosina en los fagos T-pares. En los RNA de transferencia (t. RNA) se encuentran • Ribotimidina, • Dihidrouridina, • Seudouridina • Inosina (I).

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I La estructura del DNA REGLAS DE CHARGAFF (fines de la década del ‘ 40) Para el DNA doble cadena (ds. DNA) • La composición de bases varía de una especie a otra. • La composición de bases es la misma en distintos tejidos de una misma especie. • La proporción de Adenina (A) es igual a la de Timina (T). %A = %T. • La proporción de Guanina (G) es igual a la de Citosina (C). %G= %C. • La proporción de bases púricas (A+G) es igual a la de las bases pirimidínicas (T+C). (A+G) = (T + C). • La proporción entre (A+T) y (G+C) es característica de cada organismo, pudiendo tomar por tanto, diferentes valores según la especie estudiada.

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I % de bases en distintos organismos HMC = hidroximetil-citocina

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I La estructura del DNA PATRON DE DIFRACCION DE RAYOS X Principios de la década del ‘ 50 • Patrón helicoidal del DNA. • Dos periodicidades a los largo del eje, una primaria de 3, 4 A y una secundaria de 34 A. "The instant I saw the picture my mouth fell open and my pulse began to race. " -- James D. Watson (1968), The Double Helix, page 167. New York: Atheneum, Library of Congress card number 68 -16217.

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Estructura del DNA: la doble hélice (1953) • El esqueleto hidrofìlico de grupos fosfato y deoxiribosa alternantes está expuesto al agua del ambiente • El anillo de furanosa está en la conformación C-2´endo • Las bases están apiladas en el interior de la doble hélice, con sus planos perpendiculares al eje de la doble hélice • El apareamiento de las dos cadenas genera un surco mayor y un surco menor en la superficie de la doble hélice G C A T James Watson & Francis Crick, 1953, Nature, vol 171, 737 -738

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I • Cadenas antiparalelas La estructura del DNA

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Fuerzas que estabilizan la doble hélice • Enlaces de hidrógeno (pequeña contribuión) • Apilamiento de bases e interacción hidrofóbica • Interacciones iónicas: - Repulsión entre las cargas negativas de los fosfatos - Los cationes actúan como contraiones estabilizando el DNA (divalentes más eficientes que monovalentes; el Mg+2 estabiliza la estructura del RNA)

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Comparación de las formas A, B y Z del DNA La forma B es la más estable en condiciones fisiológicas

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I DNA A: 75% agua (esporos), Na+ DNA B: 92% agua Watson & Crick DNA Z: poli-pur-pyr, -GCGC… alta [Na+]

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Horquillas (hairpins) Estructuras inusuales Palíndromos (palindromes) Repeticiones en espejo (mirror repeats) Cruciformes (cruciforms)

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Estructuras inusuales: triplex DNAs Apareamiento tipo Hoogsteen: Bajo ciertas condiciones, los nucleótidos pueden formar puentes de hidrógeno adicionales dando lugar a tramos de DNA de triple hélice. H-DNA: "In vitro" es posible obtener tramos de triple hélice intercalando oligonucleótidos cortos constituidos solamente por pirimidinas (timinas y citosinas) en el surco mayor de una doble hélice. No se sabe la función biológica del ADN-H aunque se ha detectado en cromosomas eucarióticos. Apareamiento tipo Hoogsteen Estables a p. H bajos (citocina protonada, C+) H-DNA

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Estructuras inusuales: cuadruplex DNA cuadruplexo: "In vitro" se han obtenido cuartetos de guanina (DNA cuadruplexo) unidas mediante enlaces tipo Hoogsteen, empleando polinucleótidos que solamente contienen Guanina (G). Los extremos de los cromosomas eucariotas (telómeros) tienen una estructura especial con un extremo 3' OH de cadena sencilla (monocatenario) en el que se repite muchas veces en tandem una secuencia rica en guaninas. Se piensa que el DNA cuadruplexo telomérico serviría para proteger los extremos cromosómicos de la degradación enzimática. Ejemplo de secuencia telomérica en guaninas (G): 5´P TTGGGGTTGGGG. . . . TTGGGG 3'OH

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Estructura del RNA El RNA es químicamente más reactivo que el DNA

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I La estructura del RNA Typical right-handed stacking pattern of single stranded RNA. The bases are shown in gray, the phosphate atoms in yellow, and the riboses and phosphate oxygens in green. Secondary structure of RNAs. (a) Bulge, internal loop, and hairpin loop. (b) The paired regions generally have an A-form right-handed helix, as shown for a hairpin.

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Las moléculas de ss. RNA pueden exhibir conformaciones variadas

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Estructuras secundarias en RNA t. RNA

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Tipos principales de RNA que fabrican las células Las células producen varios tipos de RNA Tipo de RNA Función m. RNA mensajeros, codifican proteínas 1 -5 % r. RNA ribosómicos, forman la estructura básica de los ribosomas y catalizan la síntesis de proteínas 80 % t. RNA de transferencia, cruciales en la síntesis de proteínas como adaptadores entre el m. RNA y los aminoácidos 10 -15 % sn. RNA pequeños nucleares, participan en varios procesos nucleares, incluyendo la maduración del prem. RNA sno. RNA pequeños nucleolares participan en el procesamiento y modificación química de los r. RNA Otros RNA Participan en diversos tipos celulares, como la síntesis de los telómeros, la inactivación del cromosoma X y el transporte de proteínas

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Los RNAs no-codificantes Perkins et al. , 2015. Expanding the ‘central dogma’: the regulatory role of nonprotein coding genes and implications for the genetic liability to schizophrenia. Molecular Psychiatry (2005) 10, 69– 78

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos • Medio ácido y alcalino • Densidad de flotación (ultracentrifugación en gradientes de densidad) • Espectro UV • Temperatura de desnaturalización (estabilidad de la doble hélice a medida que se incrementa la temperatura)

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Hidrólisis química en medio ácido Ácidos fuertes: escinden tanto los enlaces fosfodiéster como los enlaces N-glicosídicos. Ácidos débiles: escinden los enlaces N-glicosídicos. Los enlaces de las purinas son más lábiles que los de las pirimidinas. Se obtiene ácido nucleico sin bases púricas

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Hidrólisis química en medio alcalino RNA Clivaje del enlace fosfodiester

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Densidad de los ácidos nucleicos Existe una relación lineal entre el contenido en G+C y la densidad del DNA determinada en un gradiente de densidad. A mayor contenido en G+C, mayor densidad. Basándose en múltiples estudios de la densidad de los DNAs de diferentes organismos y de su composición en bases nitrogenadas, se ha establecido una fórmula empírica que relaciona la densidad de flotación ( ) con el contenido en G+C expresado en %: = 1, 660 + 0, 00098(G+C)

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Desnaturalización del DNA Doble cadena (ds) Simple cadena (ss)

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Desnaturalización del DNA Condiciones que favorecen la desnaturalización • Alta temperatura • Baja fuerza iónica (repulsión de fosfatos) • Alto p. H (desprotonación de bases) Monitoreo de la desnaturalización • Los enlaces conjugados de las bases generan absorción en el UV a 260 nm Nucleótidos libres> ss. ADN> ds. ADN • La temperatura a la cual la A 260 alcanza la mitad de su valor máximo es denominada Tm (temperatura de melting) • La Tm depende de la concentración salina, p. H, composición, longitud • Oligonucleótidos cortos: Tm (o. C) = (A+T)x 2 + (C+G)x 4 Cálculo de Tm • Oligonucleótidos largos: Tm = 81. 5 +16. 6 Log [Na+] + 0. 41 (%CG) – (625/N) (N=longitud del oligo) DESNATURALIZACION POR CALOR

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Parámetros que intervienenen en la desnaturalización del DNA Parámetro Efecto sobre Tm Composición de bases Incremento de Tm con el aumento del %G-C No ejerce efecto <150 bp; incremento de Tm con el incremento de longitud; >500 bp no hay efecto Incrementa la velocidad con la longitud Fuerza iónica Incremento de Tm con el aumento de [Na+] Optimo a 1. 5 M Na+ % bp mismatch Disminuye Tm con el aumento de %mismatch Disminuye la velocidad con el aumento de %mismatch Concentración No ejerce efecto Aumenta la velocidad con el aumento de [DNA] disminuye Tm con el aumento de [formamide], [urea] Optimo a 50% formamide Longitud Agentes denaturalizantes Temperatura - Efecto sobre la velocidad de renaturalización Optima a 20°C por debajo de Tm

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Efecto hipercrómico The purine and pyrimidine bases in DNA absorb UV light maximally at a wavelength of approximately 260 nm. In double-stranded DNA, however, the absorption is decreased due to base-stacking interactions. When DNA is denatured, these interactions are disrupted an increase in absorbance is seen. This change is called the hyperchromic effect. The extent of the effect can be monitored as a function of temperature

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Renaturalización • La desnaturalización es un proceso reversible • Reanealling: reasociación de las cadenas de DNA Algunos usos experimentales de la hibridación de ácidos nucleicos: • PCR • Southern blot • Northern blot • in situ hybridization • D-loop or R-loop mapping • Cot curves

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Avances científicos • Disociación y reasociación de las hebras complementarias del DNA (hibridación de sondas) • Replicación del DNA in vitro (síntesis de genes usando cada una de las hebras de la doble hélice como molde para la copia) • PCR (amplificación de un segmento de DNA en un tubo de ensayo) • Síntesis de DNA a partir de RNA (transcriptasa reversa de retrovirus)

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Avances científicos • Enzimas de restricción (tijeras mágicas para cortar DNA en forma precisa) • Ligasa (pegamento especial para unir trozos de DNA: permite la construcción de moléculas recombinantes) • Enzimas de restricción + ligasa = DNA recombinante (ingeniería genética)

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Hibridación Reasociación de secuencias complementarias secuencia blanco + sonda • DNA: Southern blot • RNA: Northern blot • Marcación radioactiva, fluorescente, quimioluminiscente, etc.

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I Southern blot

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I PCR (Polymerase chain reaction)

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I En resumen… üPrimeras evidencias sobre los ácidos nucleicos. üNaturaleza química de los ácidos nucleicos. üBases, nucleósidos y nucleótidos. üEstructura química y estabilidad del DNA. üTipos de estructura de DNA (A, B, Z). üEstructura y tipos de RNA. üHidrólisis y densidad de los ácidos nucleicos. üEfecto hipercrómico. üDesnaturalización (térmica, por solventes y agentes caotrópicos) üAvances científicos en base a la desnaturalización y renaturalización de los ácidos nucleicos.

¿Preguntas? pagostino@unq. edu. ar