Transferencia de material gentico II Aislamiento de plsmidos

Transferencia de material genético II Aislamiento de plásmidos

Objetivos � Conocer los fundamentos para la purificación del DNA plasmídico y su separación del DNA � Realizar el aislamiento de DNA plasmídico

Estructura del ADN James Watson y Francis Crick en 1953 demostraron que la estructura del ADN consiste en una doble hélice formada por dos cadenas.

DNA

DNA � La extensión de DNA que tiene cada organismo no es la misma. � El DNA a pesar de su extensión tiende a formar una estructura helicoidal compacta.

Estructura del DNA � Doble hélice � Estabilizada por puentes de hidrógeno � En la célula generalmente superempacada o superenrollada

Conformaciones de un plásmido � Linealizado: Es decir cuando se ha cortado ambas cadenas del DNA sólo una vez. � Parcialmente linealizado: Cuando se ha cortado el DNA en una de las cadenas � DNA relajado circular. DNA que no se ha empacado. � Superenrrollado: Covalentemente cerrado y muy empacado � Superenrollado desnaturalizado. Parecido al anterior pero un poco menos empacado

Conformaciones distintas del DNA: Superenrollamiento

Pero como vemos el superenrollamiento? Abierto Relajado Superenrollado � El superenrollado es más compacto y por tanto migra más rápido en el gel

¿Cómo afecta el superenrollamiento del DNA a la función de la célula? 1. Induce cambios locales en el DNA que desestabilizan la doble cadena y esto afecta la transcripción o cambia la unión de proteínas al DNA. 2. Induce cambios globales en el DNA, los cual hace que secuencias de DNA distantes se acerquen y facilita la compactación del DNA y la recombinación sitio específica

Puentes de hidrógeno en el DNA � DNA estructura helicoidal ◦ Estructura estabilizada por puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas (A=T; G≡C) � Superenrollamiento � Desnaturalizar- Renaturalizar: Romper y rehacer puentes de hidrógeno

DNA se puede desnaturalizar Calor, p. H, ↑ iones se eliminan sus puentes de hidrógeno.

EFECTO HIPERCRÓMICO Al monitorear su absorbencia a 260 m se observa que hay un aumento en está conforme alteramos o despegamos la doble hélice EFECTO HIPERCRÓMICO

Tm � Temperatura a la cual el 50% del DNA se encuentra en la forma desplegada.

La re-naturalización � El DNA se puede volver a renaturalizar. � Hay que hacerlo en condiciones suaves para que el apareo de bases sea el correcto. � De no ser así se pueden producir agregados fácilmente precipitables.

Obtención del plásmido � Paso 1: Lisis celular � Generalmente se realiza con detergentes lleva detergentes para solubilizar la membrana

Obtención del plásmido � Paso 2: Precipitación de proteínas y desnaturalización del DNA � Se perturban los puentes de hidrógeno entre cadenas � Se añade generalmente Na. OH

Obtención del plásmido � Paso 3: Renaturalización del DNA � Se neutraliza el p. H de la solución y se renaturaliza el DNA, PERO NO TODO!!!

Fundamento Lisis alcalina � Cuando los puentes de hidrógeno entre las cadenas complementarias del DNA plasmídico circular se rompen, ya sea por calentamiento o por un p. H alcalino, las cadenas permanecen cercanas ya que el enrollamiento de las dos cadenas no se ha perturbado grandemente. � En contraste, las cadenas lineales o rotas de DNA cromosomal se renaturalizan rápidamente ya sea por enfriamiento o al restaurar el p. H neutro de la solución y la fidelidad de la reasociación es substancialmente diferente para ambas macromoléculas.

Continuación. . . � Paso 4: Separación del DNA cromosomal del DNA plasmídico y su purificación � El DNA cromosomal está agregado y al centrifugar se queda en el botón � El DNA renaturalizado se queda en la solución, el sobrenadante

� El experimento

Cuantificación � A. B. C. D. Una vez que se tenga el plásmido purificado entonces: Correr una muestra en un gel de agarosa Medir la absorbancia a 260 nm. Estimar la concentración. Guardar a – 20°C para usar en la próxima sesión

Continuamos con: � Ensayo de restricción (2 h incubación de DNA con enzimas) � Corrimiento electroforético: Gel de agarosa (aprox 45 min) Siguiente sesión experimental � Inducción de proteína recombinante (Alcanzar DO 0. 6 en 1. 5 h; inducción 1. 5 h) � Corrimiento electroforético: Gel de poliacrilamida (45 min)

Preparación de un gel de agarosa para el corrimiento electroforético del plásmido y los productos de restricción