TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II INDUCCIN DE PROTENA

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II: INDUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE

OBJETIVOS § Conocer el fundamento de la inducción de la síntesis de proteínas recombinantes en E. coli § Realizar la inducción de una proteína recombinante (β-lactamasa) §Obtener la curva temporal de inducción de una proteína recombinante §Interpretar el patrón electroforético de producción de una proteína recombinante §Conocer las aplicaciones biotecnológicas de las proteínas recombinantes

Proteínas recombinantes v Proteínas producidas artificialmente a partir de genes clonados v Aislamiento de la secuencia génica (ARNm) y traducción de la proteína blanco v Introducción en un organismo (Procariota / Eucariota) v Expresión y purificación de la proteína blanco

Tecnología de DNA recombinante: Aislamiento de un gen de un organismo para introducirlo en otro

Clonación del DNA • DNA foráneo (secuencia que se desea clonar) • Vector de clonación (vehículo) • Organismo huésped (E. coli) • Selección de vectores Vector híbrido o recombin ante

Vector de clonación p. ET-24 a(+)

Mecanismo de acción del IPTG en la expresión de la proteína mediada por el vector p. ET Promotor T 7 Promotor del bacteriófago T 7 Controla la alta expresión de la RNA polimerasa T 7 Una copia del gen cromosomal de la RNA polimerasa T 7 bajo el control del operador de la lactosa

IPTG Un inductor del operón lac efectivo y no metabolizable que se usa a menudo experimentalmente es el isopropiltiogalactósido (IPTG). Estos inductores no metabolizables permiten la separación de la función fisiológica de la lactosa como fuente de carbono para el crecimiento de su función en la regulación de la expresión génica.

El IPTG suele utilizarse como inductor artificial del operón lac, ya que es capaz de unirse al represor Lac. I, pero no es un sustrato para la β-galactosidasa y no puede ser metabolizado por la bacteria.

Se utiliza una bacteria lisógena BL 21 (DE 3), en cuyo cromosoma se ha insertado el gen que codifica la T 7 ARN pol precedido del promotor lac. UV 5. La expresión del gen de T 7 ARN pol se controla mediante el promotor Lac. UV 5. Este es un promotor del operón lactosa é inducible por la IPTG. Sólo niveles muy débiles de expresión de T 7 RNA pol se producen cuando éste no es inducido.