Asignatura ANLISIS QUMICO Grado Ciencia y Tecnologa de

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 TEMA 9 TÉCNICAS LUMINISCENTES 1

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 CONTENIDOS 1. Introducción - Fluorescencia, Fosforescencia, Quimioluminiscencia Características analíticas 2. Teoría de la Fluorescencia y Fosforescencia 3. Tipo de espectros 4. Variables que afectan a la Fluorescencia – – – Fluorescencia y estructura Fluorescencia y entorno químico Fluorescencia y concentración 5. Instrumentación 6. Aplicaciones al análisis de alimentos 2

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 1. Introducción Métodos luminiscentes moleculares • Basados en la emisión de radiación electromagnética por moléculas que previamente han sido excitadas. • Cada especie A emite radiaciones de λ características Análisis cualitativo • La intensidad de la radiación IF es proporcional a la [A] Análisis cuantitativo A Absorción de fotones (hδ ) Fluorescencia A* A + hδ Espectro de emisión Análisis cualitativo Análisis Cuantitativo Reacción química Fosforescencia Quimioluminiscencia 3

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 1. Introducción • La fluorescencia es un fenómeno que fue conocido en el siglo XIX por Stoke: observó fluorescencia en el mineral de fluorita. Excitación Emisión Luz UV Fig. 1 Luz λ mayor • El agua tónica es un refresco carbonatado aromatizado con quinina. La quinina es un alcaloide de sabor amargo que se extrae de la corteza del árbol de la quina, y tiene propiedades antipiréticas, analgésicas y contra la malaria. La quinina es una sustancia fluorescente Agua tónica Bajo luz del sol Fig. 2 Bajo luz ultravioleta 4

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 1. Introducción Características analíticas • Sensibilidad (ppb) Características • Gran intervalo lineal • Selectividad • Menor aplicabilidad que los métodos de absorción • Mayor interferencia ambiental 5

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Teoría de la fluorescencia y de la fosforescencia A + hδexcitación A* A + hδemisión E 1 hδexcitación hδemisión λexcitación λemisión hδemisión E 0 Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia. • Estado electrónico molecular singlete: los espines de los e- están apareados Estado singlete fundamental Estado singlete excitado Fluorescencia Estado triplete excitado Fosforescencia • Estado electrónico molecular triplete: los espines de los e- están desapareados 6

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Teoría de la fluorescencia y de la fosforescencia Diagrama parcial de energía para un sistema fotoluminiscente Estados singletes excitados Conversión interna Estados tripletes excitados Relajación vibracional S 2 Cruce entre sistemas S 1 Energia T 1 Conversión interna Absorción excitación Fluorescencia Relajación vibracional S 0 Estado fundamental Fosforescencia λ 2 λ 1 λF λP

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Teoría de la fluorescencia y de la fosforescencia Velocidad de absorción y de emisión La velocidad a la que un fotón de radiación es absorbido es grande: el proceso requiere del orden de 10 -14 a 10 -15 s La emisión fluorescente, tiene lugar a una velocidad relativamente más lenta, entre 10 -9 a 10 -5 s, y depende inversamente de la absortividad molar del pico de absorción correspondiente al proceso de excitación La emisión fosforescente requiere tiempos del orden de 10 -4 a 10 s ó más. 8

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Teoría de la fluorescencia y de la fosforescencia Procesos de desactivación El camino más probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida del estado excitado Estado excitado RELAJACIÓN VIBRACIONAL: no radiante CONVERSIÓN INTERNA: no radiante CONVERSIÓN EXTERNA: no radiante CRUZAMIENTO ENTRE SISTEMAS: no radiante FLUORESCENCIA: emisión de un fotón de radiación FOSFORESCENCIA: emisión de un fotón de radiación Estado fundamental La fotoluminiscencia sólo la presentan un número relativamente pequeño de sistemas con características estructurales y ambientales que hacen que la velocidad de los procesos de desactivación no radiantes sean mas lentos que los de emisión. 9

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 3. Tipos de espectros de fluorescencia y fosforescencia Espectros de excitación y emisión de fluorescencia y fosforescencia • Espectro de excitación: Se obtiene al registrar la intensidad de fluorescencia, manteniendo fija la λemisión y variando la λexcitación • Espectro de emisión : Se obtiene al registrar la intensidad de fluorescencia manteniendo fija la λexcitación y variando la λemisión. • Los análisis se efectúan seleccionando λexcitación y λemisión máximas. Fenantreno Excitación Emisión Fluorescente Emisión 10 Fosforescente

Curso académico: 2012/13 Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos 3. Tipos de espectros de fluorescencia y fosforescencia Espectros de excitación y emisión de fluorescencia Cada uno es una imagen especular del otro. Las emisión son mayores que excitación 11

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 3. Tipos de espectros de fluorescencia y fosforescencia Espectros de excitación y emisión de fluorescencia Antraceno a) espectro excitación b) espectro fluorescente Cada uno es una imagen especular del otro 12

Curso académico: 2012/13 Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos 4. Variables que afectan a la fluorescencia Estructura química Sustancia fluorescente Entorno químico Intensidad de emisión fluorescente 13

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Variables que afectan a la fluorescencia Rendimiento cuántico de fluorescencia: = nº moléculas que emiten fluorescencia/nº total de moléculas excitadas = nº fotones emitidos/nº fotones absorbidos = KF / KF + Kces + Kce + Kci + Kpd + Kd K = las constantes de velocidad de los diversos procesos de desactivación posibles: fluorescencia (KF), cruce entre sistemas (Kces), conversión externa (Kce), conversión interna (Kci), predisociación (Kpd) y disociación (Kd ). Las variables que conducen a valores altos de KF y valores bajos del resto de velocidades exaltan la fluorescencia KF, Kpd, Kd Kces, Kce, Kci Estructura química Entorno químico Rendimiento cuántico y tipo de transición: ØLa eficacia cuántica es mayor para las transiciones - * 14

Curso académico: 2012/13 Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos 4. Variables que afectan a la fluorescencia Fluorescencia y estructura Pueden presentar fluorescencia: • Compuestos con estructuras con dobles enlaces altamente conjugados. • Compuestos que contienen grupos carbonilo en estructuras alifáticas • La fluorescencia más intensa es la que presentan los compuestos que contienen grupos funcionales aromáticos con transiciones π → π* de baja energía Fenantreno • La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en disolución. • La eficacia cuántica normalmente aumenta con el número de anillos y con su grado de condensación Antraceno Fig. 1 Fig. 2 15

Curso académico: 2012/13 Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos 4. Variables que afectan a la fluorescencia Fluorescencia y estructura Heterociclos sencillos no fluorescentes Fusionados con anillos bencénicos sí presentan fluroescencia 16

Curso académico: 2012/13 Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos 4. Variables que afectan a la fluorescencia Fluorescencia y estructura. Efecto de los sustituyentes La sustitución en el anillo bencénico produce: • Desplazamientos de la de los máximos de excitación y emisión • Un aumento o disminución de la intensidad de fluorescencia según el sustituyente 17

Curso académico: 2012/13 Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos 4. Variables que afectan a la fluorescencia Fluorescencia y estructura. Efecto de los sustituyentes üLos electrodonadores: -NH 2, -NHR, -NR 2, -OH, y –OR, aumentan la eficacia de la fluorescencia desplazándola a mayores . üLos electroaceptores: -COOH, -COOR, -CHO, -COR y –NO 2, reducen la eficacia de la fluorescencia al introducir una transición n-p *. üLos halógenos producen efecto de átomo pesado interno üLos grupos sulfónicos no modifican significativamente la fluorescencia 18

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Variables que afectan a la fluorescencia Fluorescencia y estructura. Efecto de la rigidez estructural =1 = 0, 2 • La fluorescencia aumenta con la rigidez molecular. • La emisión fluorescente aumenta cuando los colorantes fluorescentes se adsorben en una superficie sólida ya que aumenta su rigidez: Indicadores de adsorción • La influencia de la rigidez también explica el aumento de la fluorescencia de ciertos agentes quelantes orgánicos cuando forman complejos con iones metálicos. • Por ejemplo, la intensidad de fluorescencia de la 8 -hidroxiquinoleína es mucho menor que la de su complejo de zinc 19

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Variables que afectan a la fluorescencia Fluorescencia y entorno químico • Disolvente La fluorescencia de una molécula disminuye en presencia de disolventes que contengan átomos pesados: tetrabromuro de carbono, yoduro de etilo • Temperatura Un aumento de temperatura provoca disminución de I F IF Temperatura ºC 20

Curso académico: 2012/13 Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos 4. Variables que afectan a la fluorescencia Fluorescencia y entorno químico • p. H Influye en la fluorescencia de compuestos aromáticos con sustituyentes ácidos o básicos en el anillo. Anilina If = 20 Ión anilinio IF = 0 • Oxígeno disuelto ØReduce la intensidad de fluorescencia de una disolución 21

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Variables que afectan a la fluorescencia Fluorescencia y concentración • La intensidad de emisión fluorescente (IF) es proporcional a la potencia radiante de la luz incidente (P 0) y a la concentración de la especie fluorescente (c), si la absorbancia de la disolución es pequeña a las longitudes de onda de excitación y de emisión. Análisis cuantitativo IF = k P 0 c IF = K c Al aumentar P 0 aumenta IF Relación entre la intensidad de fluorescencia y la concentración Análisis de trazas Para concentraciones de analito altas, IF deja de ser proporcional a c 22

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 5. Instrumentación Esquema de un espectrofluorímetro Fuente de radiación Monocromador de excitación λexc Una longitud de onda Cubeta de muestra Luminiscencia a muchas longitudes de onda Muchas longitudes de onda en ángulo recto Monocromador de emisión Una longitud de onda λem Detector Registrador o PC 23

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 5. Instrumentación Fuente de luz • De mayor potencia que las que se utilizan en absorción. • La energía radiante emitida en fluorescencia es directamente proporcional a la intensidad de la fuente. • Lámpara de arco de mercurio, • Lámpara de arco de xenón, • Láseres de N 2 o de Ar Selección ex y em Cubetas • Filtros: fluorímetro • Monocromadores : espectrofluorímetro • Vidrio o cuarzo • Rectangulares, con las cuatro caras pulimentadas Detectores Tubos fotomultiplicadores. 24

Curso académico: 2012/13 Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos 6. Aplicaciones Análisis cualitativo • Poca aplicación. • la fluorescencia es valiosa en la identificación de derrames de petroleros. Análisis cuantitativo ØLa aplicación más importante de la fluorimetría corresponde al análisis de productos alimenticios, sustancias farmacéuticas, muestras clínicas y productos naturales • Los métodos fluorescentes son : • Aplicables a intervalos de concentración más bajos los de absorción • Tienen sensibilidades mayores que los métodos de absorción. • Tienen una precisión y exactitud menor que las de los de absorción. • Muy selectivos, con una selectividad mayor que los métodos de absorción. 25

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 6. Aplicaciones Análisis cuantitativo Se han desarrollado métodos cuantitativos basados en fluorescencia para especies inorgánicas, orgánicas y bioquímicas. Determinación de especies inorgánicas • Los basados en la reacción del analito con un agente de complejación para formar un complejo fluorescente. Se utilizan para cationes • Determinación de Al (III) El granate de alizarina R permite detectar Al 3+ a niveles de 0, 007 µg/m. L. GAR + Al (III) GAR - Al (III) Los indirectos, basados en la disminución de la fluorescencia, quenching, como resultado de la interacción del analito con un reactivo fluorescente. Se utilizan para aniones y determinación de oxígeno en disolución. Determinación de anión F-, se basa en la desactivación de la fluorescencia del complejo GAR - Al (III) + FGAR + Al(III)-F 26

Curso académico: 2012/13 Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos 6. Aplicaciones Análisis cuantitativo Determinación de sustancias orgánicas y bioquímicas • El número de aplicaciones de los métodos fluorimétricos a problemas orgánicos es muy elevado • Pueden determinarse por fluorescencia los aminoácidos, proteínas, coenzimas, vitaminas, ácidos nucleicos, alcaloides, porfirinas, esteroides, flavonoides, la adenina, ácido antranílico, hidrocarburos policíclicos aromáticos, cisteína, guanina, isoniazida, naftoles, ácido salicílico, triptófano, ácido úrico y numerosos metabolitos. • También muchos agentes medicinales pueden determinarse por fluorimetría, como la adrenalina, morfina, penicilina, fenobarbital, procaína, reserpina y dietilamida del ácido lisérgico (LSD). • La aplicación más importante de la fluorimetría corresponde al análisis de productos alimenticios, sustancias farmacéuticas, muestras clínicas y productos naturales. 27

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 6. Aplicaciones al análisis de alimentos • Determinación de cationes y aniones • Determinación de quinina • Determinación de colorantes • Determinación de pesticidas • Determinación de vitaminas 28

Curso académico: 2012/13 Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICO Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos CRÉDITOS DE LAS ILUSTRACIONES – PICTURES COPYRIGHTS -Logo encabezado páginas OCW-UM. Autor: Universidad de Murcia. Dirección web: http: //ocw. um. es. . -Página 4. Fig. 1. Dirección web: http: //commons. wikimedia. org/wiki/File: Fluorite. Berbes. jpg. Author: Didier Descouens. -Página 4. Fig. 2. Dirección web: http: //commons. wikimedia. org/wiki/File: Tonic_water_uv. jpg. Author: User: Splarka from en: wp -Página 15, Fig. 1. Dirección web: http: //commons. wikimedia. org/w/index. php? title=File: Anthracene_acsv. svg&page=1. Author: Calvero. -Página 15, Fig. 2. Dirección web: http: //commons. wikimedia. org/wiki/File: Fenantrene. PNG. 29