TBT 633 MKROBYAL BYOTEKNOLOJ Ders ierii Mikrobiyal Biyoteknoloji
TBT 633 MİKROBİYAL BİYOTEKNOLOJİ
Ders içeriği Mikrobiyal Biyoteknoloji tanım-tarihçe DNA, Replikasyon, transkripsiyon, translasyon, gen ifadesinin düzenlenmesi Rekombinant DNA teknolojisi Omiks dünyası: genomik, proteomik, transkriptomik, metagenomik, metabolomik Suşların izolasyonu ve taranması Mikrobiyal üreme kinetikleri: kesikli ve sürekli kültür, fermantasyon teknolojisi, biyofilm, immobilize hücreler Proteinlerin rekombinant mikroorganizmalar tarafından büyük ölçekli üretimleri, protein mühendisliği, direkt mutagenez Biyokatalizler: doğal enzimler ve varyantları Mikroorganizmaların endüstriyel kullanımları: ticari ürünler, biyopolimerler, aminoasitler, etanol BİYOREMEDİASYON, ATIK SU ARITIMI, AĞIR METALLERİN UZAKLAŞTIRILMASI, biyomadencilik, biyoyakıtlar PGPR’LER, mikrobiyal insektisitler, gut mikrobiyota Antibiyotik ve aşı üretimi Alternatif enerji üretimi
Gen ifadesinin düzenlenmesi
Gen: RNA ve Protein moleküllerini kodlamak için gerekli bütün genetik bilgileri içeren DNA parçasına gen denir. Genom: Bir organizmanın bütün genlerinin toplamına genom denilir. Gen ifadesi: Transkripsiyon ve translasyon süreçlerine gen ifadesi denir.
Gen ifadesinin özgüllüğü • Zamana bağlı spesifiklik-Temporal specificity Neden bebeklerde aktif iken yaşlandıkça değil? • Yere bağlı spesifiklik(doku özgüllüğü): neden beyin hücresinde aktif ama karaciğer hücresinde aktif değil?
Gen ifadesinin özgüllüğü
Gen ifadesinin çeşitleri a. Sürekli ifade Bazı genler hayat için mutlak gerekli olan genlerdir ve sürekli ifade edilmeleri gerekir. Örneğin hücre solunumu ile ilgili genler. Bu genlere housekeeping genler denir.
b. Uyarılma ve baskılama Bazı genlerin ifade düzeyleri dışardan gelen uyarıcı sinyallere verilen tepkilere bağlı olarak değişkenlik gösterebilir.
Bazı genler bir defa uyarılınca yüksek ifade düzeyine ulaşır. Bu durum uyarılmış ifade olarak adlandırılır. Diğer taraftan bazı genler baskılanmıştır ve ifade düzeyleri düşüktür. Bu durum ise baskılanmış ifade olarak adlandırılır.
Düzenleyici Unsurlar • Gen ifadesi çok basamaklı bir süreçtir. • Transkripsiyon başlangıcı gen ifadesinin kontrol edilmesindeki ana noktadır.
Transkripsiyonun düzenleyen temel faktörler: a. Özel DNA dizileri b. Düzenleyici proteinler c. DNA-protein etkileşmesi ve protein-protein etkileşmesi d. RNA polimerase
a. Özel DNA dizisi Prokaryotik sistemler için: Operon , yapısal genler, promotör, operatör, ve diğer düzenleyici dizilerden oluşmuştur. Promotör Diğer düzenleyici diziler Operatör Yapısal genler
Promotör RNA-polimerazın DNA’ ya bağlanarak transkripsiyonu başlattığı bölgedir.
Operatör Repressör proteinin bağlanarak transkripsiyonu engellediği ve yapısal genlerin bitişiğindeki DNA dizisi operatör olarak tanımlanmıştır. RNp. Aropmooter l reoppreerastsoorr structural gene
ökaryotik sistemler için: Cis-acting elementler kendi geninin ifadesini etkileyen DNA dizileridir. start B A structural gene
b. Düzenleyici proteinler Prokaryotik sistemler: • Spesifik faktör: RNA-polimerazın belirli DNA dizilerine bağlanmasını kolaylaştırırlar • Repressör: Operatör bölgesine bağlanarak transkripsiyonu engeller ve negatif düzenleme olarak adlandırılır. • Aktivatör: Başlangıc noktasının yakınında DNA ile etkileşime girerek RNA polimerazın bağlanma afinitesini arttırır ve transkripsiyonun verimliliğini arttırır.
Ökaryotik sistemler: • Düzenleyici proteinler transkripsiyon faktörleridir (TF). • Genin ifade edilmesinden sonra, TF cis-acting elementlerle etkileşime girerek diğer genleri aktif hale getirir. Bundan dolayı trans-acting elementler olarak adlandırılır.
Trans-acting faktörler DNA a m. RNA protein A A A b
c. DNA-protein etkileşimleri • Bu düzenleme cis-acting elementler ve trans-acting faktörler arasında karşılıklı etkileşimler ile yürütülür. • Bu etkileşimler non-kovalent bağlar şeklindedir.
Protein-protein etkileşimleri • Proteinler DNA’ya bağlanmadan önce birbirleriyle de etkileşime girerler. • Proteinler fonksiyonlarını daha iyi gerçekleştirmek adına homo ve hetero-dimer şeklini alırlar • Hem prokaryotlarda hem de ökaryotlarda görülür.
Prokaryotik sistemlerde gen ifadesinin düzenlenmesi
Genel Özellikler • Prokaryotik genler policistronik systemlerdir, dolayısıyla birbiriyle ilişkili birçok gen tek bir transkript oluşturmak üzere bir araya gelebilir ve operon adını alırlar. • Gen ifadesinin düzenlenmesi genellikle negatif şekildedir. Uyarıcılar baskılamayı kaldırmak için kullanılır.
Transkripsiyonun düzenlenmesi • Operon transkripsiyonun düzenlenmesi için koordinasyon birimidir. • Transkripsiyonun başlaması düzenleme için en önemli noktadır. Ayrıca translasyonda düzenlenebilir.
lac operonun yapısı regulatory site I P structural gene Z O operator promoter CAP-binding site regulatory gene A Y transacetylase permease ¦ -galactosidase
Laktoz metabolizması
Uyarılabilen gen ifadesi • Ortamda glukoz olduğu zaman bakteri bu üç enzimi üretmez. Bakteri bu enzimleri ortamda glukoz olmayıp laktoz bulunduğu durumlarda üretir.
lac operon • lac operon (TTTACA/TATGTT) zayıf bir promotöre sahiptir, bazal bir ifade düzeyine sahiptir. • CAP (Catabolite gene activator protein) bağlanma bölgesi -60 bölgesindedir. • CAP hem DNA’ya hemde c. AMP’ye bağlanabilecek uygun nükleotid dizilerine sahiptir.
• Glukoz c. AMP oluşumunu engeller. • Glukoz ortamda olduğu zaman, [c. AMP] konsatrasyonu düşüktür. Glukoz tamamen üketilince, [c. AMP] konsantrasyonu artmaya başlar. The CAP-c. AMP birliği oluşur, ve bu birlik lac operonun CAP binding site (Cap bağlanma bölgesine) bağlanır.
Durum 1 Laktoz yoksa, lac geni ifade edilmez. I m. RNAPpol O Z Y A
• lac. I geni kendi promotörüne sahiptir ve bunun aktivitesi sonucunda Lac. I repressör üretilir. • Tetramerik Lac repressör lac operator bölgesine Olac bağlanır. • Bu bağlanma RNA polimerazın DNA üzerindeki hareketini engeller böylece lac. Z, lac. Y, and lac. A genleri ifade edilmez.
Durum 2 Laktoz ortamda bulunduğu zaman, lac. Z, lac. Y, ve lac. A genleri ifade edilmeye başlanır. I P O Z RYNAp. Aol m. RNA repressor galactosidase allolactose
• Galaktosidaz bazal durumda çok az ifade edilir. • Ortamda laktoz olduğu durumlarda hemen allalaktoz ve galaktoza dönüştürülür ve repressöre bağlanır. • Repressör artık operatör bölgesine bağlanamaz ve lac genleri ifade edilebilir. • Galaktoz, Allalaktoz ve İPTG uyarıcı (inducer) olarak adlandırılır.
uyarıcılar
Durum 3 Glukozun bulunduğu durumda, [c. AMP] konsantrasynu düşüktür ve CAP-c. AMP oluşamaz , lac operonun ifade düzeyi oldukça düşük seviyelerde gerçekleşir. CAP I RNPApol O Z Y A
Durum 4 Glukozun olmadığı ve laktozun bulunduğu durumlarda CAP-c. AMP birlikteliği CAP bölgesine bağlanarak lac genlerinin aktivasyonunu sağlar. c. AMP CAP I RNPApol O Z Y A
Koordineli ifade şekli Laktoz - Laktoz + Glukoz RNA pol O Glukoz + RNA pol O
Transkripsiyonun yavaşlatılması Trp operon • trp operon bazal düzeyde konstitif olarak (sürekli) ifade edilen genlerden biridir. • trp operonun yapısındaki genler TRP sentezinde görev alan 5 farklı enzimi kodlarlar.
• trp repressör geni ifade edilebilir ama operatör bölgeye bağlanmaz. • TRP gereğinden fazla üretildiği zaman repressör Trp ile birliktelik oluşturarak operatör bölgesine bağlanır ve Trp sentezini durdurur.
Trp operon structural gene regulatory regions R P E O trp L D C B A attenuator Trp m. RNA attenuated m. RNA Trp
Yavaşlatma mekanizması • Repressör düzenlenmesine ilaveten, trp genleri yavaşlatma olarak adlandırılan ve çok iyi çalışan bir ayarlama mekanizmasına sahiptirler. • trp operonu yavaşlatma mekanizması kullanılarak translasyon seviyesinde kontrol edilebilirler.
Lider bölge
Muhtemel saç tokaları 1/2 ve ¾ saç tokası yapısı 2/3 saç tokası yapısı
Yüksek Trp konsantrasyonu
Antisense RNA • spesifik bir RNA transkriptine veya m. RNA’ ya komplementer dizisi bulunan ve m. RNA’nın transkripini veya da translasyonunu engelleyen RNA molekülü.
Ökaryotik transkripsiyonun düzenlenmesi
Yapısal özellikler • Büyük genom: 3 x 109 bps, 35 000 gen • Monocistron • Tekrarlanmış diziler: farklı büyüklük ve farklı sıklıkta. Çoğunlukla ters tekrarlardan oluşmakta. • Mozaik gen yapısı: intron ve exonlar
Düzenlemenin özellikleri 1. RNA-pol: Farklı RNA’lar için 3 farklı RNA polimeraz (I, II, and III) 2. Farklı kromozom yapıları • Çok hassas bölge yapısı • Baz modifikasyonu • İzomer dönüşümü • Histon değişiklikleri
3. Pozitif düzenleme 4. Transkripsiyon ve translasyon ayrılmış durumdadır 5. Transkripsiyon sonrası modifikasyonlar oldukça fazladır 6. Hücre içi ve hücreler arası sinyaller yardımıyla gen ifadesinin düzenlemesi görülür.
Cis-acting elementler • Bunlar DNA molekülüne spesifiklerdir ve bir yada birden fazla genin transkripsiyonunu düzenlerler. Genellikle korunmuş DNA bölgelerine sahiptirler. • Promotör: TATA kutusu, CAAT kutusu, ve GC kutusu
TATA kutusu • Dizi: TATAAAA • Lokasyon: - 25 ~ - 30 bp • Fonksiyonu: RNA polimerazın bağlanması içine gerekli olan TFII D için bağlanma bölgesi görevi görür. Transkripsiyonel başlangıcın sıklığını ve doğruluğunu kontrol eder.
CAAT kutusu • Dizi: GCCAAT • Lokasyon: ~ -70 bp • Fonksiyon: CTF 1 (CAAT-binding transcription factor) ve C/EBP (enhancer binding protein) için bağlanma bölgesi görevi görür.
GC kutusu • Dizi: GGGCGG • Lokasyon: -30 ~ -110 bp • Fonksiyon: Sp 1 proteini için bağlanma bölgesidir.
Enhancer. Arttırıcı • Transkripsiyonun zamana ve yere bağlı olarak spesifikliğini ayarlayan ve promotör aktivitesini arttıran DNA dizisidir.
Susturucu • negatif düzenleme elementidir. • Spesifik proteinle etkileştiği zaman transkripsiyonu durdurur.
Trans-acting faktörler • Dolaylı olaral cis-acting elementlere bağlanan ve transkripsiyonun başlamasını düzenleyen proteinlerdir. • trans-acting faktörler transkripsiyon faktörleri (TF).
transkripsiyon faktörleri • Genel transkripsiyon faktörleri • Özel transkripsiyon faktörleri – Transkripsiyon aktivitörleri EBP (enhancer bağlanma proteini) – Transkripsiyon engelleyiciler
TF’lerinin genel yapısı • DNA-bağlanma bölgesi • Aktivasyon bölgesi • Protein-protein etkileşim bölgesi
- Slides: 58