Spettrometria di massa Serve a misurare la massa

Spettrometria di massa Serve a misurare la massa delle molecole. Fornisce la massa molecolare, e anche la formula molecolare La molecola deve essere ionizzata, così da misurare il rapporto massa/carica (m/z) dello ione risultante. Sorgente La sorgente serve a volatilizzare e ionizzare il campione Analizzatore L'analizzatore serve a misurare il rapporto m/z degli ioni prodotti Detector Il detector serve a rivelare gli ioni che arrivano dall'analizzatore

I componenti dello spettrometro Sorgente Analizzatore Detector m/z Spettro Computer

Sorgente Analizzatore Sorgenti: · · · Sorgente EI (impatto elettronico) Sorgente CI (ionizzazione chimica) Sorgente FAB (fast atom bombarment) Sorgente electrospray Sorgente MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization). Analizzatori: · · Analizzatore magnetico Analizzatore a quadrupolo Analizzatore a trappola ionica (ion-trap) Analizzatore TOF (time of flight – tempo di volo)

Meccanismi di ionizzazzione Espulsione di Protonazione: Cationizzazione: Deprotonazione: e -: M M + H+ M + Cat+ MH +. M + e. MH+ MCat+ M - + H+

Sorgente EI (impatto elettronico) Sorgente CI (ionizzazione chimica) Sorgente FAB (fast atom bombarment) Sorgente electrospray Sorgente MALDI

Spettrometro di massa EI/magnetico sorgente accelleratore analizzatore L’apparecchio è sotto alto vuoto, con una pressione intorno ai 10 -5 -10 -6 Tor. Il campione deve essere allo stato di vapore. Le molecole dal campione vaporizzato sono colpite da elettroni ad elevata energia (tipicamente 70 e. V) emessi da un filamento incandescente. La grandissima parte degli ioni ha carica unitaria e si tratta quindi di ioni-radicali M + e- = M+. + 2 e-

Lo ione molecolare può non essere visibile Eccessiva frammentazione La sostanza deve essere volatilizzata

Gli ioni sono accelerati da un intenso potenziale elettrostatico verso l’analizzatore. Un campo magnetico è in grado di far deviare particelle cariche in movimento, per cui gli ioni provenienti dalla sorgente possono seguire la curvatura del tubo. L’entità della deviazione dipende dall’intensità del campo magnetico, dall’energia fornita dal potenziale elettrostatico e dal rapporto m/z dello ione. In particolare per ogni valore di potenziale elettrostatico e campo magnetico, solo ioni con un ben preciso rapporto m/z riusciranno ad attraversare la fenditura posta alla fine dell’analizzatore, ed arrivare quindi al collettore di ioni, che genera un segnale elettrico dipendente dall’intensità della corrente ionica che lo colpisce.

L'analizzatore a quadrupolo consiste in un tubo rettilineo in cui è fatto il vuoto ed in cui sono presenti quattro barre parallele, disposte simmetricamente intorno all'asse del tubo, di sezione circolare oppure iperbolica. Le barre diametralmente opposte sono in contatto elettrico tra di loro, mentre tra barre adiacenti è applicata un voltaggio formato da due componenti: una differenza di potenziale continua e una oscillante ad alta frequenza. Lo ione entra nell'analizzatore parallelamente all'asse z, ed è spinto dai campi elettrici continuo e oscillante a seguire una traiettoria a spirale.

La trappola ionica è un analizzatore a quadrupolo con barre iperboliche piegato su se stesso in modo da formare un' anello. L'elettrodo centrale (il "buco della ciambella") è eliminato, ed il voltaggio continuo ed alternato sono applicati tra l'elettrodo esterno e gli elettrodi inferiore e superiore, che diventano due superfici convesse. Due piccoli buchi sugli elettrodi inferiore e superiore permettono la introduzione e l'uscita degli ioni. E’ possibile intrappolare per un tempo lungo a piacere gli ioni e farli frammentare grazie alla presenza di un gas.

Peso molecolare della sostanza sotto indagine Frammentazioni

Picchi isotopici: HCl H 35 Cl MW 36 (75%) H 37 Cl MW 38 (25%) BILANCIA 6. 02 1023 molecole = 1 mol = 36. 55 g Sorg. Analizzatore MS m/z 36 m/z 38 (75%) (25%)

Picchi isotopici: Et. OH 13 CH CH 3 CH 2 OH MW 46 MW 47 1. 1% Sorg. CH 313 CH 2 OH MW 47 1. 1% BILANCIA MS 3 CH 2 OH Analizzatore m/z 46 m/z 47 (2. 2 %) 6. 02 1023 molecole = 1 mol = 46. 07 g

Picchi isotopici M+1 M+2 1. 1% (numero di C)+ 0. 36% (numero di N) Cl (33% di M) Br (100% di M) S (4% di M)

Frammentazioni La sorgente ad impatto elettronico produce ioni-radicali. Gli ioni radicali sono generalmente molto instabili, e possono frammentare: o, più semplicemente:

Frammentazioni Due grandi classi di frammentazioni: (scissione semplice) (riarrangiamento) Sono favorite le frammentazioni che portano a frammenti stabili. Con la spettrometria di massa è possibile rivelare solo i frammenti carichi

Frammentazioni semplici favorite: formazione di carbocationi allilici, benzilici, secondari o terziari e ioni ossonio

(catione tropilio) Riarrangiamenti: carbonilici riarrangiamento di Mc. Lafferty, tipico dei composti (riarrangiamento di Mc. Lafferty) (è necessario un H in g al CO)

Alcani § ione molecolare piccolo ma visibile § frammentazioni di tutti i legami C-C: picchi separati di 14 (Cn. H 2 n+1, m/z 43, 57, 71, 85, 99…)

Idrocarburi aromatici § ione molecolare intenso § alchilbenzeni: ione tropilio a m/z 91 (anche m/z 105, 119, ecc, se ci sono a-ramificazioni)

Alcoli alifatici · ione molecolare è sempre molto debole o assente · importante picco M-18 (perdita di acqua)

Alcoli alifatici

Chetoni · frammentazione C-CO (rottura del legame , rispetto ad un ossigeno) · frammentazione è quella di Mc. Lafferty:

Aldeidi · picco ad M-1 (piuttosto caratteristico), picco a m/z 29 (CHO+). · altri picchi caratteristici sono M-18 (perdita i acqua), M-28 (perdita di etilene), M-43 e M-44). · riarrangiamento di Mc. Lafferty (m/z 44, se non c’è ramificazione in a)

Acidi carbossilici · riarrangiamento di Mc. Lafferty (m/z 60 per acidi non ramificati in , spesso il picco base). · rotture delle catene alchiliche

Ammine · ione molecolare è a massa dispari (regola dell’azoto) · ione molecolare è comunque debole, e a volte assente · la frammentazione ricorda quella degli alcoli · rottura del legame , all’N

Sorgente FAB Sorgente MALDI Sorgente ESI Non richiedono volatilizzazione

Consiste nel disperdere il campione in una matrice (tipicamente glicerina) su cui vengono sparati aromi pesanti neutri ad elevata velocità.

Gli atomi veloci sono prodotti dal cosiddetto cannone atomico in cui viene introdotto il gas, Ar o Xe, che per effetto di una sorgente elettronica, diventano Ar+. oppure Xe+. . Questi ioni vengono fatti entrare in una camera di collisione in cui è presente Argon o Xeno gassoso; gli ioni, urtando gli atomi cedono la loro energia cinetica generando così un flusso di atomi neutri che escono dalla camera di collisione ad elevata velocità ed impattano contro la matrice che contiene disperso il campione da analizzare. Alla fine della camera di collisione vi è un potenziale positivo che provvede a respingere eventuali ioni che con si siano scontrati con Xe o Ar gassoso.

Glicerolo C 3 H 8 O 3, m/z 92. 0473 La matrice più usata nel FAB Scelta migliore per i composti polari Utilizzabile per FAB positivi e negativi Problemi per la formazione di addotti che complicano la lettura degli spettri Tioglicerolo C 3 H 8 O 2 S, m/z 108. 0245 maggiore acidità più volatile del glicerolo Problemi per la formazione di addotti che complicano la lettura degli spettri

Spettro di massa FAB+ del glicerolo [Matr + H]+, [2 Matr + H]+, [3 Matr + H]+, [4 Matr + H]+

Alcol 3 -nitrobenzilico C 7 H 7 NO 3, m/z 153. 0416 ottimo per FAB + formazione di addotti Trietanolammina C 6 H 15 NO 3, m/z 149. 1052 matrix ottimo per FAB formazione di addotti

Bassa sensibilità Limite di massa registrabile: 2000 -3000 Dalton Interferenza della matrice

La ionizzazione Maldi prevede l’ irradiazione con una luce laser (l 337 nm) di una piccola superfice (100 mm di diametro) in cui è posto il campione, cristallizzato con una matrice, conseguente riscaldamento dell’area di irradiazione e e vaporizzazione delle molecole organiche.

La matrice assorbe energia dall’irradiazione della luce laser, si riscalda e può agire conseguentemente come donatore di protoni formando ioni pseudomolecolari di tipo [M+H]+. Per composti con una elevata affinità per i cationi si possono formare anche addotti di tipo [M+Na]+, [M+K]+.

Il TOF è un tubo vuoto non sottoposto a campo elettrico e magnetico in cui è fatto il vuoto e si base sul principio che ioni di differente m/z acquistano, nella fase di accelerazione, differenti velocità. v = (2 z. Vacc /m)1/2 Per cui impiegheranno tempi differenti percorrerre un determinato spazio L t = (m/2 z. Vacc)1/2 L Elaborando questa esperessione si ottiene la relazione tra tempo di volo e rapporto massa/carica: t = a (m/z)1/2 + b

Il detector converte l’energia cinetica delle particelle in arrivo in segnale elettrico. Sia ioni che particelle neutre dotate di energia cinetica passano attraverso la zona di volo alla cui fine è posto un dinodo. Quest’ ultimo rappresenta una speciale superficie capace di emettere una corrente di elettroni in risposta all’urto con una particella dotata di energia cinetica. A causa di una differenza di potenziale positiva, la corrente elettrica giunge ad un secondo dinodo e causa un rilascio di corrente amplificata.

Senza limite di massa registrabile Buona sensibilità Problemi nella deposizione della matrice e del campione Bassa risoluzione v. Ioni dello stesso tipo che partono dalla matrice in tempi diversi v Generazione di ioni metastabili v Ioni dello stesso tipo che acquistano differenti Ec nella fase di accellerazione

Si usa per evitare che ioni dello stesso tipo partano in tempi diversi dalla matrice. Ciò è dovuto al fatto che il laser riscalda prima una certa zona del pozzetto i cui ioni partiranno logicamente prima di quelli ottenuti da zone più lontane da quella di incidenza del laser

Il delayed extraction consiste nell’applicare un voltaggio prima della zona di accelerazione così da focalizzare tutti gli ioni di stesso m/z

TOF lineare o con reflector Il TOF con reflector risolve sia il problema degli ioni metastabili che il problema delle differenti Ec acquisite durante la fase di accellerazione

Un esempio

La sostanza è introdotta in soluzione in un ago capillare e ne fuoriesce sotto forma di aerosol (goccioline di diametro di 1 -2 mm). Tra l’ago e il mantello della camera (elettrodo cilindrico) è creata una differenza di potenziale di alcuni KV che induce sulle goccioline un eccesso di carica positiva. A causa delle loro ridotte dimensioni, il solvente evapora rapidamente da ogni gocciolina che diventa sempre più piccola; la densità di carica aumenta finchè diventa così alta da determinare l’espulsione di ioni di soluto dalla gocciolina. Gli ioni così prodotti sono poi spinti attraverso un sistema di fenditure fino ad entrare nella zona a bassa pressione dove sono accelerate verso l’analizzatore

Una delle caratteristiche dell’ESI è la possibilità di generare ioni multicarica. Per molti composti il numero di cariche è proporzionale alla grandezza del composto in esame per cui il rapporto m/z per le molecole che arrivano all’analizzatore è dell’ordine di 500 -2000. Inoltre il numero di cariche assunte dalla molecola dipende sia dalla presenza di gruppi basici che dal p. H del solvente.

Qual è la massa

Per peptidi di massa incognita, è possibile stabilire il numero di cariche dello ione dal valore di m/z del primo picco isotopico (M+1). Ad esempio per un peptide di massa incognita registriamo uno ione molecolare a m/z 1001. In tal caso potremmo trovarci nel caso che il peptide pesi 1000 e lo ione molecolare corrisponda allo ione [(M+H)]+ oppure il peptide pesi 2000 ed ha addizionato 2 cariche [(M+2 H)]+2 (m/z 1001). La soluzione deriva dalla massa del picco 13 C: nel primo caso sarà a valori di m/z 1002 mentre nel secondo caso lo troveremo a valori di m/z 1001. 5.

ü Picchi consecutivi differiscono per una carica. m/z= (M+n)=1546 n m/z= (M+n+1)=1374 n+1 M e n

Esistono degli algoritmi, detti di convoluzione, che permettono di ricavare uno spettro in cui è presente un solo picco al reale valore di massa. Mioglobina

üAnalisi di molecole molto grandi üElevata sensibilità senza interferenza delle matrici üAssenza di frammentazione üAccoppiamento con HPLC üSistemi MS/MS ü Formazione di ioni multicarica misti con riduzione della sensibilità

L’ESI è la sorgente di ionizzazione di prima scelta negli apparecchi LC-MS. Il problema da considerare derivano dalla necessità di interfacciare la camera di ionizzazione, che è sotto vuoto spinto, e l’apparecchio HPLC a pressione ordinaria

HPLC Può essere Solido-liquido Liquido-liquido

Cromatogramma ottenuto in gradiente

La nebulizzazione è favorita dal gas La vaporizzazione dal riscaldamento La ionizzazione da una scarica elettrica

Informazioni ottenibili dalla spettrometria di massa di un polipeptide. üPeso molecolare üSequenza amminoacidica frammentazioni dallo studio delle

Esempio lo spettro di massa della proinsulina bovina di formula molecolare C 381 H 586 N 107 O 114 S 6 non mostra un solo picco corrispondente allo ione molecolare [M+H]+ a m/z 8676. 1 (massa monoisotopica), ma un insieme di picchi che tengono conto della distribuzione isotopica. Il picco a maggiore intensità ha massa nominale di 8681 ed è esso stesso costituito da 10 differenti specie isotopiche. In totale i picchi presenti nello spettro contengono 62 specie isotopiche.

Specie isotopiche contribuiscono allo ione a m/z 8681

La tabella mostra i valori di massa dei comuni residui amminoacidici presenti in un peptide. La massa monoisotopica è calcolata tenendo conto delle masse atomiche esatte per ciascun isotopo degli atomi del frammento (C=12. 000 Da, H=1. 00783 Da, N=14. 0031 Da, O=15. 9949, S=31. 9721). La massa media corrisponde alla massa ottenuta mediando tutti gli isotopi per ciascun elemento che compone il frammento.

La frammentazione di uno ione molecolare di un polipeptide può produrre molti ioni di frammentazione. Sebbene la frammentazione possa essere un processo spontaneo e consequenziale alla ionizzazione, essa è resa più efficiente se lo ione molecolare, ad es. [M+H]+, è fatto collidere con molecole di gas inerte (CID: decomposizione indotta dalla collisione). Le frammentazioni possono avvenire producendo frammenti N-terminali (A, B, C) che C-terminali (X, Y, Z). Nomenclatura di Roepstroff e Folhmann

I legami che possono rompersi sono: Ca-C=O, C=O-NH, NH-Ca I frammenti che sono registrati sono solo quelli carichi Se la carica è portata dal frammento N-terminale gli ioni prodotti sono indicati come a, b, c (a seconda del legame rotto nella frammentazione: Ca. C=O, C=O-NH, NH-Ca) Se la carica è portata dal frammento C-terminale gli ioni prodotti sono indicati come x, y, z (a seconda del legame rotto nella frammentazione: Ca. C=O, C=O-NH, NH-Ca). Il pedice indica il numero di residui presenti nel frammento prodotto Gli ioni c e y si formano con trasferimento di un altro protone dal peptide.

Frammentazioni di tipo a (rottura del legame Ca-C=O) per un pentapeptde Massa del residuo – C=O +1= massa del residuo -27

Frammentazioni di tipo b (rottura del legame C=O-NH) Massa del residuo + 1

Frammentazioni di tipo c (rottura del legame NH-Ca) Massa del residuo + NH 3 +1 Massa del residuo+18

Frammentazioni di tipo x (rottura del legame Ca-C=O) Massa del residuo + OH +C=O= Massa del residuo +17+28

Frammentazioni di tipo y (rottura del legame C=O-NH) Massa del residuo + OH +2 Massa del residuo +19

Frammentazioni di tipo z (rottura del legame NH-Ca) Massa del residuo – NH + OH= Massa del residuo +2

Frammentazione N-terminale a b c Massa residuo -27 Massa residuo +18 Frammentazione C-terminale x Massa residuo +45 y z Massa residuo +19 Massa residuo +2

Frammentazioni interne Una tipica frammentazione interna può essere fornita dallo ione Nterminale a che evolve ulteriormente a formare uno ione di tipo immonio. Alcuni ammino acidi danno ioni immonio molto intensi e quindi utili per informazioni di sequenza. Residuo Sigla a tre lettere Sigla a 1 lettera massa ione immonio Istidina His H 110 Isoleucina Ile I 86 Leucina Leu L 86 Fenilalanina Phe F 120 Prolina Pro P 70 Triptofano Trp W 159 Tirosina Tyr Y 136

VLSPAD K V b 2 b 3 b 5 b 6

y"4* y"5* *= y"7* y"6* y"3* C* b 10 y"8* y"10* y"9* b 11* y"12*

Alpha (17 -31)

Alpha(41 -56)

Alpha(62 -90)

Beta (83 -95)

Regole generali per determinare la composizione e la sequenza Gli ioni immonio sono utili per l’identificazione degli aa che compongono il peptide e cadono a bassi m/z e sono molto intensi Le frammentazioni più comuni riguardano il legame peptidico (b e y) I frammenti ad elevati m/z corrispondono a bn-1 e yn-1 e sono molto intensi MH+-yn-1= ultimo residuo N-terminale = b 1 -1 (poco intenso e basso m/z) MH+-bn-1 -18= ultimo residuo C-terminale = y 1 -19 (poco intenso e basso m/z)

b 1 H 2 N A +H+ b 3 b 2 B C y 3 D y 2 OH y 1 N-terminale = b 1 -1= MH+-y 3 C-terminale = MH+-b 3 -18= y 1 -19 aa B = y 3 -y 2 aa C = b 3 -b 2

b 1 H 2 N A +H+ b 3 b 2 B C y 3 D y 2 O H b 1= 164 Tyr N-terminale y 1= 148 -19= C terminale= Glu MH+-y 3= 524 -361 Tyr MH+-b 3 -18= 524 -377 Glu aa B = y 3 -y 2= 361 -262=99 Val aa C = b 3 -b 2= 377 -263= 114 Asn y 1 MH+

b 1 H 2 N A +H+ b 3 b 2 B C y 3 D y 2 O H y 1 b 1= 132 Met N-terminale y 1= 106 -19= C terminale= Ser MH+-y 3= 481 -350 Met MH+-b 3 -18= 481 -376 Ser aa B = y 3 -y 2= 350 -203=147 Phe aa C = b 3 -b 2= 376 -279= 97 Pro

b 1 H 2 N A +H+ b 3 b 2 B C y 3 D y 2 O H y 1 b 1= 72 Ala N-terminale y 1= 147 -19= C terminale= Gln MH+-y 3= 567 -496 Ala MH+-b 3 -18= 567 -421 Gln aa B = y 3 -y 2= 496 -310=186 Trp aa C = b 3 -b 2= 421 -258= 163 Tyr

Analisi delle proteine • Cromatografia • Elettroforesi • Sequenza chimica • Analisi degli aa • Attività biologica • . .

Struttura tridimensionale

Struttura secondaria -Sheet Extended Loops Cofactors (e. g. Zn 2+ ions) -Helix

Composizione

Sequenza delle proteine Separazione mediante elettroforesi su gel 2 D Digestione enzimatica Analisi dei peptidi risultanti dalla digestione mediante massa Separazione mediante elettroforesi su gel 2 D La miscela di proteine viene dispersa su un gel di agarosio e viene applicato una differenza di potenziale lungo il gel. Le proteine migrano in differenti zone del gel a seconda del loro peso molecolare e del loro p. I.

Digestione enzimatica Comunemente è utilizzata la digestione con tripsina, un enzima in grado di rompere il legami peptidici in cui è coinvolto un residuo di Lys o Arg, che si ritrovano comunemente nelle proteine. La miscela di peptidi ottenuta dopo digestione enzimatica è sottoposta ad analisi di massa

Frammentazione del peptide CNBr Trypsin Chymotrypsin

Analisi MALDI-TOF della miscela

Analisi di massa La miscela di peptidi ottenuta dalla digestione è sottoposta ad analisi di massa. Le informazioni di peso molecolare e di sequenza ottenute dall’analisi dello spettro di massa possono essere inserite in uno dei numerosi “protein database” disponibili sul web. ESI MALDI LC/MS MS/MS

Se si usa una sorgente ESI bisogna indurre la frammentazione CVF (cone voltage fragmentation) Ion trap

ESI con Ion trap

Spettrometria di massa tandem MS/MS

Precursor Ion Selection Fragment Ion Analysis Collision Induced Dissociation

Q-TOF

TOF-TOF