Optick metody Mgr Jana Gottwaldov Optick analytick metody
![Optické metody Mgr. Jana Gottwaldová Optické metody Mgr. Jana Gottwaldová](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-1.jpg)
![Optické analytické metody • Fyzikální metody, které získávají potřebné informace z měření optických vlastností Optické analytické metody • Fyzikální metody, které získávají potřebné informace z měření optických vlastností](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-2.jpg)
![Spektrofotometrie x fotometrie l Patří mezi nejpoužívanější optické metody v biochemii l Stanovení vlastností Spektrofotometrie x fotometrie l Patří mezi nejpoužívanější optické metody v biochemii l Stanovení vlastností](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-3.jpg)
![Spektrofotometrie-rozdělení Podle frekvence elektromagnetického záření: UV spektr. – zahrnuje oblast záření λ=190400 nm VIS Spektrofotometrie-rozdělení Podle frekvence elektromagnetického záření: UV spektr. – zahrnuje oblast záření λ=190400 nm VIS](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-4.jpg)
![Spektrofotometrie-rozdělení Podle typu interakce elektromagnetického záření: l Atomovou absorpční spektrofotometrii l Atomovou emisní spektrofotometrii Spektrofotometrie-rozdělení Podle typu interakce elektromagnetického záření: l Atomovou absorpční spektrofotometrii l Atomovou emisní spektrofotometrii](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-5.jpg)
![Optické metody l jsou založeny na výměně energie mezi látkou a zářením l Světlo Optické metody l jsou založeny na výměně energie mezi látkou a zářením l Světlo](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-6.jpg)
![Elektromagnetické záření Elektromagnetické záření](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-7.jpg)
![Popisující veličiny elektromagnetického záření • rychlost – c (m/s), ve vakuu 3 x 108 Popisující veličiny elektromagnetického záření • rychlost – c (m/s), ve vakuu 3 x 108](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-8.jpg)
![Popisující veličiny elektromagnetického záření • energie fotonu světelného záření ε • Energie fotonu je Popisující veličiny elektromagnetického záření • energie fotonu světelného záření ε • Energie fotonu je](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-9.jpg)
![Elektromagnetické záření l Světlo v UV a VIS oblasti má kmitočet (počet vln za Elektromagnetické záření l Světlo v UV a VIS oblasti má kmitočet (počet vln za](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-10.jpg)
![Barevnost látek l Pokud absorbované záření má λ ležící v oblasti viditelné části spektra, Barevnost látek l Pokud absorbované záření má λ ležící v oblasti viditelné části spektra,](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-11.jpg)
![Barevnost látek Barevnost látek](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-12.jpg)
![Barevnost látek Barevnost látek](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-13.jpg)
![Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii Propustnost (transmitance): Množství světla určité vlnové délky, Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii Propustnost (transmitance): Množství světla určité vlnové délky,](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-14.jpg)
![Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii l Absorbance: Bezrozměrná veličina, definovaná na základě Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii l Absorbance: Bezrozměrná veličina, definovaná na základě](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-15.jpg)
![Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii Zákon Lambertův-Beerův: I = I 0. 10 Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii Zákon Lambertův-Beerův: I = I 0. 10](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-16.jpg)
![Zákon Lambertův-Beerův Ø absorbance při dané vlnové délce přímo úměrná tloušťce absorbující vrstvy l Zákon Lambertův-Beerův Ø absorbance při dané vlnové délce přímo úměrná tloušťce absorbující vrstvy l](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-17.jpg)
![Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii l molární absorpční koeficient ελ: fyzikální konstanta, Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii l molární absorpční koeficient ελ: fyzikální konstanta,](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-18.jpg)
![Kalibrační závislost Praktické využití Lambertova-Beerova zákona Provedení: l změříme obvykle 5 standardních roztoků o Kalibrační závislost Praktické využití Lambertova-Beerova zákona Provedení: l změříme obvykle 5 standardních roztoků o](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-19.jpg)
![Kalibrační závislost Sestrojení kalibrační křivky l naměřené hodnoty absorbance standardů na ose y l Kalibrační závislost Sestrojení kalibrační křivky l naměřené hodnoty absorbance standardů na ose y l](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-20.jpg)
![Kalibrační závislost Vzhledem k tomu, že poměr cst/Ast je pro měřenou sérii konstantní používáme Kalibrační závislost Vzhledem k tomu, že poměr cst/Ast je pro měřenou sérii konstantní používáme](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-21.jpg)
![Limitace Lambertova-Beerova zákona l Odchylka ελpři vysokých koncentracích (>0, 01 mol/l) vlivem elektrostatických interakcí Limitace Lambertova-Beerova zákona l Odchylka ελpři vysokých koncentracích (>0, 01 mol/l) vlivem elektrostatických interakcí](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-22.jpg)
![Spektrofotometry l Přístroje, které se používají k měření intenzity záření v ultrafialové (UV) nebo Spektrofotometry l Přístroje, které se používají k měření intenzity záření v ultrafialové (UV) nebo](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-23.jpg)
![Uspořádání spektrofotometru • Zdroj světla • Optický systém: štěrbiny, zrcadla, čočky • Monochromátor nebo Uspořádání spektrofotometru • Zdroj světla • Optický systém: štěrbiny, zrcadla, čočky • Monochromátor nebo](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-24.jpg)
![Zdroje záření a jejich použití l Wolframová žárovka – měření absorpce ve viditelném spektru Zdroje záření a jejich použití l Wolframová žárovka – měření absorpce ve viditelném spektru](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-25.jpg)
![Wolframová žárovka – VIS oblast spektra l Skleněná baňka naplněná inertním plynem obsahující páry Wolframová žárovka – VIS oblast spektra l Skleněná baňka naplněná inertním plynem obsahující páry](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-26.jpg)
![Deuteriová výbojka – UV oblast spektra l Nízkotlaké, produkují světlo o vlnové délce 160 Deuteriová výbojka – UV oblast spektra l Nízkotlaké, produkují světlo o vlnové délce 160](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-27.jpg)
![Xenonová výbojka – blízká UV oblast nebo IČ oblast spektra l Vysokotlaká (pevnější plášť), Xenonová výbojka – blízká UV oblast nebo IČ oblast spektra l Vysokotlaká (pevnější plášť),](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-28.jpg)
![Rtuťová výbojka – blízká UV a VIS oblast l Nízkotlaká, poskytuje přesně definované čárové Rtuťová výbojka – blízká UV a VIS oblast l Nízkotlaká, poskytuje přesně definované čárové](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-29.jpg)
![Spektrofotometr - fotometrické filtry l Slouží k vymezení určitého ( co nejužšího) pásu monochromatického Spektrofotometr - fotometrické filtry l Slouží k vymezení určitého ( co nejužšího) pásu monochromatického](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-30.jpg)
![Spektrofotometr - fotometrické filtry Křivka propustnosti transmitance Spektrální pološířka filtru (h, nm) - odpovídá Spektrofotometr - fotometrické filtry Křivka propustnosti transmitance Spektrální pološířka filtru (h, nm) - odpovídá](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-31.jpg)
![Fotometrické filtry Barevné absorpční filtry - mají nižší spektrální čistotu filtrovaného záření, jejich pološířka Fotometrické filtry Barevné absorpční filtry - mají nižší spektrální čistotu filtrovaného záření, jejich pološířka](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-32.jpg)
![Fotometrické filtry-interferenční filtry Interferenční filtry využívají mnohonásobnou interferenci záření mezi hraničními plochami s výbornými Fotometrické filtry-interferenční filtry Interferenční filtry využívají mnohonásobnou interferenci záření mezi hraničními plochami s výbornými](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-33.jpg)
![Spektrofotometr - monochromátory Optická zařízení pomocí kterých se ze spektra polychromatického světla mechanicky vymezí Spektrofotometr - monochromátory Optická zařízení pomocí kterých se ze spektra polychromatického světla mechanicky vymezí](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-34.jpg)
![Monochromátor se skládá: l vstupní štěrbiny l pomocné optiky (zrcadla, čočky) l disperzního prvku Monochromátor se skládá: l vstupní štěrbiny l pomocné optiky (zrcadla, čočky) l disperzního prvku](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-35.jpg)
![Monochromátor- vstupní a výstupní štěrbina Vstupní – vymezuje malou část světelného toku ze zdroje Monochromátor- vstupní a výstupní štěrbina Vstupní – vymezuje malou část světelného toku ze zdroje](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-36.jpg)
![Monochromátor - pomocná optika Zrcadla - jsou to plochy odrážející záření, jsou potažena obvykle Monochromátor - pomocná optika Zrcadla - jsou to plochy odrážející záření, jsou potažena obvykle](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-37.jpg)
![Disperzní prvek - optický hranol l rozkládá polychromatické světlo na principu lomu světla l Disperzní prvek - optický hranol l rozkládá polychromatické světlo na principu lomu světla l](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-38.jpg)
![Disperzní prvek – difrakční reflexní mřížka l pracuje na principu odrazu světla l Je Disperzní prvek – difrakční reflexní mřížka l pracuje na principu odrazu světla l Je](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-39.jpg)
![Výběr požadované vlnové délky ☼ Přesným pohybem disperzního prvku monochromátoru je vzniklé světelné spektrum Výběr požadované vlnové délky ☼ Přesným pohybem disperzního prvku monochromátoru je vzniklé světelné spektrum](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-40.jpg)
![kyveta difrakční reflexní mřížka detektor mikrometrický šroub zdroj světla optické zrcadlo kyveta difrakční reflexní mřížka detektor mikrometrický šroub zdroj světla optické zrcadlo](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-41.jpg)
![Spektrofotometr - Absorpční prostředí Kyveta s měřeným vzorkem Rozdělení: l dle velikosti: Makro- (1 Spektrofotometr - Absorpční prostředí Kyveta s měřeným vzorkem Rozdělení: l dle velikosti: Makro- (1](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-42.jpg)
![Absorpční prostředí spektrofotometru zatavené kyvety z plastické fólie 400 µl 150 µl 80 µl Absorpční prostředí spektrofotometru zatavené kyvety z plastické fólie 400 µl 150 µl 80 µl](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-43.jpg)
![Spektrofotometr - detekční systém Je složen z detektoru záření a elektronického zařízení pro zpracování Spektrofotometr - detekční systém Je složen z detektoru záření a elektronického zařízení pro zpracování](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-44.jpg)
![Detektor – hradlový selenový fotočlánek l Skládá se z polopropustné vrstvy stříbra nanesené na Detektor – hradlový selenový fotočlánek l Skládá se z polopropustné vrstvy stříbra nanesené na](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-45.jpg)
![Detektor – fotodioda (fotonka) Pracuje na principu fotoelektrického efektu l Skládá se z fotosenzitivní Detektor – fotodioda (fotonka) Pracuje na principu fotoelektrického efektu l Skládá se z fotosenzitivní](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-46.jpg)
![Detektor - fotonásobič • Elektrony z fotokatody jsou postupně přitahovány k sérii dynod, na Detektor - fotonásobič • Elektrony z fotokatody jsou postupně přitahovány k sérii dynod, na](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-47.jpg)
![Detektor - fotonásobič Detektor - fotonásobič](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-48.jpg)
![Detektor s diodovým polem l Je tvořen velkých množstvím miniaturních fotodiod na malé ploše Detektor s diodovým polem l Je tvořen velkých množstvím miniaturních fotodiod na malé ploše](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-49.jpg)
![Detektor s diodovým polem • Rozdíl oproti klasickému spektrofotometru – monochromátor je umístěn až Detektor s diodovým polem • Rozdíl oproti klasickému spektrofotometru – monochromátor je umístěn až](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-50.jpg)
![Konstrukce spektrofotomeru Jednopaprskové Umožňují měřit absorbanci pouze v jednom absorpčním prostředí (tj. v kyvetě Konstrukce spektrofotomeru Jednopaprskové Umožňují měřit absorbanci pouze v jednom absorpčním prostředí (tj. v kyvetě](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-51.jpg)
![Konstrukce spektrofotomeru Dvoupaprskový Dvě základní konstrukční řešení: l Paprsek určité vlnové délky z monochromátoru Konstrukce spektrofotomeru Dvoupaprskový Dvě základní konstrukční řešení: l Paprsek určité vlnové délky z monochromátoru](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-52.jpg)
![Blank ☼ M < Vzorek ☼ M Blank Vzorek Blank ☼ M < Vzorek ☼ M Blank Vzorek](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-53.jpg)
![Kontrola kvality spektrofotometru Přesnost nastavené vlnové délky Ověřuje, že vlnová délka nastavená na přístroji Kontrola kvality spektrofotometru Přesnost nastavené vlnové délky Ověřuje, že vlnová délka nastavená na přístroji](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-54.jpg)
![Kontrola kvality spektrofotometru Rozptýlené světlo Světlo, které může dopadnout na detektor aniž by prošlo Kontrola kvality spektrofotometru Rozptýlené světlo Světlo, které může dopadnout na detektor aniž by prošlo](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-55.jpg)
![Vertikální fotometrie Vertikální fotometrie](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-56.jpg)
![Vertikální fotometrie l Spektrofotometrická metoda, s uspořádáním kdy světelný paprsek prochází optickým prostředím ve Vertikální fotometrie l Spektrofotometrická metoda, s uspořádáním kdy světelný paprsek prochází optickým prostředím ve](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-57.jpg)
![ELISA - Technická instrumentace Provádí se ve speciálních nádobkách uspořádaných do tzv. mikrotitračních destiček. ELISA - Technická instrumentace Provádí se ve speciálních nádobkách uspořádaných do tzv. mikrotitračních destiček.](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-58.jpg)
![ELISA - Technická instrumentace Pro měření výsledného produktu detekční reakce se používají speciální vertikální ELISA - Technická instrumentace Pro měření výsledného produktu detekční reakce se používají speciální vertikální](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-59.jpg)
![ELISA reader (vertikální spektrofotometr) Princip: světelný paprsek ze zdroje prochází přes zvolený interferenční filtr ELISA reader (vertikální spektrofotometr) Princip: světelný paprsek ze zdroje prochází přes zvolený interferenční filtr](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-60.jpg)
![ELISA reader (vertikální spektrofotometr) ELISA reader (vertikální spektrofotometr)](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-61.jpg)
![](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-62.jpg)
![ELISA reader (vertikální spektrofotometr) Součásti vertikálního fotometru: l zdroj záření: nejčastěji používá halogenová žárovka ELISA reader (vertikální spektrofotometr) Součásti vertikálního fotometru: l zdroj záření: nejčastěji používá halogenová žárovka](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-63.jpg)
![Vertikální fotometrie l Vztah mezi změřeným signálem (absorpcí) a koncentrací se určuje kalibrací. Obvykle Vertikální fotometrie l Vztah mezi změřeným signálem (absorpcí) a koncentrací se určuje kalibrací. Obvykle](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-64.jpg)
![Vertikální fotometrie l Při ELISA metodě se vyžaduje měření všech vzorků v duplikátech. l Vertikální fotometrie l Při ELISA metodě se vyžaduje měření všech vzorků v duplikátech. l](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-65.jpg)
![ELISA automatická linka l Automatická linka provádí: l automatické pipetování vzorků, reagencií, kalibrátorů a ELISA automatická linka l Automatická linka provádí: l automatické pipetování vzorků, reagencií, kalibrátorů a](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-66.jpg)
![ELISA automatická linka l Velkou výhodou automatické linky je použití čárových kódů, a tím ELISA automatická linka l Velkou výhodou automatické linky je použití čárových kódů, a tím](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-67.jpg)
![Reflexní fotometrie Reflexní fotometrie](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-68.jpg)
![Reflexní fotometrie Princip l měření intenzity záření odraženého od neprůhledné (homogenně zbarvené) podložky. Hodnotí Reflexní fotometrie Princip l měření intenzity záření odraženého od neprůhledné (homogenně zbarvené) podložky. Hodnotí](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-69.jpg)
![Reflexní fotometr l Přístroj slouží ke kvantitativnímu vyhodnocení reakcí probíhajících na pevné fázi. Pevná Reflexní fotometr l Přístroj slouží ke kvantitativnímu vyhodnocení reakcí probíhajících na pevné fázi. Pevná](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-70.jpg)
![Reflexní fotometr - pevná fáze (matrice) l Činidla jsou v reagenční zóně proužku impregnována Reflexní fotometr - pevná fáze (matrice) l Činidla jsou v reagenční zóně proužku impregnována](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-71.jpg)
![Reflexní fotometr Odraz světla od reagenční zóny: l zrcadlový – na reflexní ploše zrcadla Reflexní fotometr Odraz světla od reagenční zóny: l zrcadlový – na reflexní ploše zrcadla](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-72.jpg)
![Hlavní komponenty reflexního fotometru Zdroj záření: l halogenová lampa l xenonová výbojka l světloemitující Hlavní komponenty reflexního fotometru Zdroj záření: l halogenová lampa l xenonová výbojka l světloemitující](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-73.jpg)
![Hlavní komponenty reflexního fotometru Ulbrichtova koule (jako zdroj difuzního světla): l dutá koule jejíž Hlavní komponenty reflexního fotometru Ulbrichtova koule (jako zdroj difuzního světla): l dutá koule jejíž](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-74.jpg)
![Hlavní komponenty reflexního fotometru l Detektor záření: l uvnitř koule jsou umístěny dva detektory. Hlavní komponenty reflexního fotometru l Detektor záření: l uvnitř koule jsou umístěny dva detektory.](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-75.jpg)
![](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-76.jpg)
![Děkuji za pozornost Děkuji za pozornost](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-77.jpg)
- Slides: 77
![Optické metody Mgr Jana Gottwaldová Optické metody Mgr. Jana Gottwaldová](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-1.jpg)
Optické metody Mgr. Jana Gottwaldová
![Optické analytické metody Fyzikální metody které získávají potřebné informace z měření optických vlastností Optické analytické metody • Fyzikální metody, které získávají potřebné informace z měření optických vlastností](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-2.jpg)
Optické analytické metody • Fyzikální metody, které získávají potřebné informace z měření optických vlastností a spekter zkoumaných látek. • využívá interakce analytu se světlem - optických vlastností molekul a atomů měřené soustavy • může jít o změnu barvy či její intenzity, luminiscenci, fluorescenci, změnu optické otáčivosti nebo o změnu rozptylu světla při průchodu vzorkem
![Spektrofotometrie x fotometrie l Patří mezi nejpoužívanější optické metody v biochemii l Stanovení vlastností Spektrofotometrie x fotometrie l Patří mezi nejpoužívanější optické metody v biochemii l Stanovení vlastností](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-3.jpg)
Spektrofotometrie x fotometrie l Patří mezi nejpoužívanější optické metody v biochemii l Stanovení vlastností vzorku, např. koncentrace určité látky, na základě pohlcování světla určité vlnové délky se označuje jako fotometrie.
![Spektrofotometrierozdělení Podle frekvence elektromagnetického záření UV spektr zahrnuje oblast záření λ190400 nm VIS Spektrofotometrie-rozdělení Podle frekvence elektromagnetického záření: UV spektr. – zahrnuje oblast záření λ=190400 nm VIS](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-4.jpg)
Spektrofotometrie-rozdělení Podle frekvence elektromagnetického záření: UV spektr. – zahrnuje oblast záření λ=190400 nm VIS spektr. – oblast viditelného záření λ=400800 nm IČ spektr. – oblast IČ spekter se dělí na blízkou IČ λ=800 -2000 nm, dalekou IČ λ=105 nm
![Spektrofotometrierozdělení Podle typu interakce elektromagnetického záření l Atomovou absorpční spektrofotometrii l Atomovou emisní spektrofotometrii Spektrofotometrie-rozdělení Podle typu interakce elektromagnetického záření: l Atomovou absorpční spektrofotometrii l Atomovou emisní spektrofotometrii](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-5.jpg)
Spektrofotometrie-rozdělení Podle typu interakce elektromagnetického záření: l Atomovou absorpční spektrofotometrii l Atomovou emisní spektrofotometrii l Turbidimetrii, nefelometrii l Luminiscenční metody: fluorimetrie, fosforescence, chemiluminiscence
![Optické metody l jsou založeny na výměně energie mezi látkou a zářením l Světlo Optické metody l jsou založeny na výměně energie mezi látkou a zářením l Světlo](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-6.jpg)
Optické metody l jsou založeny na výměně energie mezi látkou a zářením l Světlo je druhem elektromagnetického záření l Vlastnosti elektromagnetického záření - má duální charakter l Složku magnetickou a elektrickou l Vzdálenost mezi dvěma vrcholy vln se nazývá vlnová délka- λ, udává se v nm
![Elektromagnetické záření Elektromagnetické záření](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-7.jpg)
Elektromagnetické záření
![Popisující veličiny elektromagnetického záření rychlost c ms ve vakuu 3 x 108 Popisující veličiny elektromagnetického záření • rychlost – c (m/s), ve vakuu 3 x 108](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-8.jpg)
Popisující veličiny elektromagnetického záření • rychlost – c (m/s), ve vakuu 3 x 108 m/s • vlnová délka - (nm) • Frekvence světelných vln (=počet vln za sekundu) - (Hz, s-1)
![Popisující veličiny elektromagnetického záření energie fotonu světelného záření ε Energie fotonu je Popisující veličiny elektromagnetického záření • energie fotonu světelného záření ε • Energie fotonu je](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-9.jpg)
Popisující veličiny elektromagnetického záření • energie fotonu světelného záření ε • Energie fotonu je přímo úměrná jeho kmitočtu, h je Planckova konstanta (6, 625 x 10 -34 J/s) • Energie fotonu je nepřímo úměrná vlnové délce tzn. že světelné záření o kratší vlnové délce má vyšší energii, než světlo s delší vlnovou délkou
![Elektromagnetické záření l Světlo v UV a VIS oblasti má kmitočet počet vln za Elektromagnetické záření l Světlo v UV a VIS oblasti má kmitočet (počet vln za](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-10.jpg)
Elektromagnetické záření l Světlo v UV a VIS oblasti má kmitočet (počet vln za s) 1014 -1015 Hz l Monochromatické - světlo, které se skládá pouze z jedné vlnové délky l Polychromatické – skládá se z mnoha vlnových délek (sluneční světlo, světlo wolframové žárovky)
![Barevnost látek l Pokud absorbované záření má λ ležící v oblasti viditelné části spektra Barevnost látek l Pokud absorbované záření má λ ležící v oblasti viditelné části spektra,](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-11.jpg)
Barevnost látek l Pokud absorbované záření má λ ležící v oblasti viditelné části spektra, látka se jeví lidskému oku jako barevná l Má vždy barvu doplňkovou k barvě absorbovaného světla
![Barevnost látek Barevnost látek](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-12.jpg)
Barevnost látek
![Barevnost látek Barevnost látek](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-13.jpg)
Barevnost látek
![Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii Propustnost transmitance Množství světla určité vlnové délky Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii Propustnost (transmitance): Množství světla určité vlnové délky,](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-14.jpg)
Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii Propustnost (transmitance): Množství světla určité vlnové délky, které prošlo vzorkem Kde I 0 je intenzita světla vstupujícího do vzorku a I je intenzita světla ze vzorku vystupujícího
![Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii l Absorbance Bezrozměrná veličina definovaná na základě Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii l Absorbance: Bezrozměrná veličina, definovaná na základě](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-15.jpg)
Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii l Absorbance: Bezrozměrná veličina, definovaná na základě Transmitance, udává jaké množství světla bylo pohlceno vzorkem.
![Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii Zákon LambertůvBeerův I I 0 10 Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii Zákon Lambertův-Beerův: I = I 0. 10](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-16.jpg)
Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii Zákon Lambertův-Beerův: I = I 0. 10 -ε l c Intenzita světelného záření procházející absorbujícím prostředím klesá exponenciálně v závislosti na délce absorbující vrstvy a koncentraci absorbující látky (Johan Heinrich Lambert, 1728 -1777)
![Zákon LambertůvBeerův Ø absorbance při dané vlnové délce přímo úměrná tloušťce absorbující vrstvy l Zákon Lambertův-Beerův Ø absorbance při dané vlnové délce přímo úměrná tloušťce absorbující vrstvy l](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-17.jpg)
Zákon Lambertův-Beerův Ø absorbance při dané vlnové délce přímo úměrná tloušťce absorbující vrstvy l Ø koncentraci absorbujících částic ve vrstvě c Ø Konstanta úměrnosti pro danou látku a danou vlnovou délku absorbovaného záření je molární absorpční koeficient ελ
![Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii l molární absorpční koeficient ελ fyzikální konstanta Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii l molární absorpční koeficient ελ: fyzikální konstanta,](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-18.jpg)
Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii l molární absorpční koeficient ελ: fyzikální konstanta, která udává jak daná látka při určité koncentraci absorbuje monochromatické záření určité vlnové délky l Takto lze zjistit koncentraci látek barevných, nebo látek absorbujících světlo v UV oblasti l Pokud látka v těchto oblastech neabsorbuje, je třeba ji převést na látku, která absorbuje více l Vztah mezi signálem ( absorbancí) a koncentrací se určuje kalibrace
![Kalibrační závislost Praktické využití LambertovaBeerova zákona Provedení l změříme obvykle 5 standardních roztoků o Kalibrační závislost Praktické využití Lambertova-Beerova zákona Provedení: l změříme obvykle 5 standardních roztoků o](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-19.jpg)
Kalibrační závislost Praktické využití Lambertova-Beerova zákona Provedení: l změříme obvykle 5 standardních roztoků o známé vrůstající koncentraci při určité vlnové délce l všechny roztoky se měří za stejných experimentálních podmínek (spektrometr, kyveta, pipety, doba inkubace. . ) l blank = slepý pokus, obsahuje vše kromě stanovované látky
![Kalibrační závislost Sestrojení kalibrační křivky l naměřené hodnoty absorbance standardů na ose y l Kalibrační závislost Sestrojení kalibrační křivky l naměřené hodnoty absorbance standardů na ose y l](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-20.jpg)
Kalibrační závislost Sestrojení kalibrační křivky l naměřené hodnoty absorbance standardů na ose y l hodnoty koncentrace na ose x Pokud je závislost lineární, je možné změřit absorbanci a vypočítat koncentraci neznámého vzorku
![Kalibrační závislost Vzhledem k tomu že poměr cstAst je pro měřenou sérii konstantní používáme Kalibrační závislost Vzhledem k tomu, že poměr cst/Ast je pro měřenou sérii konstantní používáme](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-21.jpg)
Kalibrační závislost Vzhledem k tomu, že poměr cst/Ast je pro měřenou sérii konstantní používáme ho pro změřenou sérii jako kalibrační faktor, kterým vynásobíme naměřené hodnoty absorbance vzorků o neznáme koncentraci LOD-dolní mez detekce LOL- horní mez detekce LOQ-mez stanovitelnosti
![Limitace LambertovaBeerova zákona l Odchylka ελpři vysokých koncentracích 0 01 moll vlivem elektrostatických interakcí Limitace Lambertova-Beerova zákona l Odchylka ελpři vysokých koncentracích (>0, 01 mol/l) vlivem elektrostatických interakcí](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-22.jpg)
Limitace Lambertova-Beerova zákona l Odchylka ελpři vysokých koncentracích (>0, 01 mol/l) vlivem elektrostatických interakcí l Částečný rozptyl světla na částicích přítomných ve vzorku l Fluorescence nebo fosforescence vzorku l Nedokonale monochromatické záření l Nekoherentní světelné záření Nejpřesnější výsledky jsou získávány v rozsahu absorbancí 0, 2 -0, 7. Od hodnot absorbance > výrazně narůstá chyba měření
![Spektrofotometry l Přístroje které se používají k měření intenzity záření v ultrafialové UV nebo Spektrofotometry l Přístroje, které se používají k měření intenzity záření v ultrafialové (UV) nebo](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-23.jpg)
Spektrofotometry l Přístroje, které se používají k měření intenzity záření v ultrafialové (UV) nebo viditelné (VIS) oblasti spektra l Slouží pro měření absorpce světla vzorkem l Absorbance je měřena při různých vlnových délkách
![Uspořádání spektrofotometru Zdroj světla Optický systém štěrbiny zrcadla čočky Monochromátor nebo Uspořádání spektrofotometru • Zdroj světla • Optický systém: štěrbiny, zrcadla, čočky • Monochromátor nebo](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-24.jpg)
Uspořádání spektrofotometru • Zdroj světla • Optický systém: štěrbiny, zrcadla, čočky • Monochromátor nebo filtr: k výběru určité vlnové délky • Absorpční prostředí: kyveta s měřeným vzorkem • Detekční systém: zařízení k měření světelného záření, které prošlo vzorkem
![Zdroje záření a jejich použití l Wolframová žárovka měření absorpce ve viditelném spektru Zdroje záření a jejich použití l Wolframová žárovka – měření absorpce ve viditelném spektru](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-25.jpg)
Zdroje záření a jejich použití l Wolframová žárovka – měření absorpce ve viditelném spektru l Deuteriová (vodíková) výbojka - měření absorpce v UV spektru l Xenononová výbojka- měření absorpce v oblasti VIS UV spektru l Rtuťová výbojka – měření v oblasti spektra 200 -400 nm
![Wolframová žárovka VIS oblast spektra l Skleněná baňka naplněná inertním plynem obsahující páry Wolframová žárovka – VIS oblast spektra l Skleněná baňka naplněná inertním plynem obsahující páry](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-26.jpg)
Wolframová žárovka – VIS oblast spektra l Skleněná baňka naplněná inertním plynem obsahující páry jódu l Uvnitř je wolframové vlákno, které je zahříváno stejnosměrným proudem
![Deuteriová výbojka UV oblast spektra l Nízkotlaké produkují světlo o vlnové délce 160 Deuteriová výbojka – UV oblast spektra l Nízkotlaké, produkují světlo o vlnové délce 160](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-27.jpg)
Deuteriová výbojka – UV oblast spektra l Nízkotlaké, produkují světlo o vlnové délce 160 -360 nm
![Xenonová výbojka blízká UV oblast nebo IČ oblast spektra l Vysokotlaká pevnější plášť Xenonová výbojka – blízká UV oblast nebo IČ oblast spektra l Vysokotlaká (pevnější plášť),](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-28.jpg)
Xenonová výbojka – blízká UV oblast nebo IČ oblast spektra l Vysokotlaká (pevnější plášť), výboj vzniká mezi dvěma wolframovými vlákny, potřebuje intenzivní chlazení
![Rtuťová výbojka blízká UV a VIS oblast l Nízkotlaká poskytuje přesně definované čárové Rtuťová výbojka – blízká UV a VIS oblast l Nízkotlaká, poskytuje přesně definované čárové](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-29.jpg)
Rtuťová výbojka – blízká UV a VIS oblast l Nízkotlaká, poskytuje přesně definované čárové spektrum (200 -400 nm) l Pro klinickou biochemii je významná spektrální čára o vlnové 334 nm – pro měření redukované formy NADP (absorpční maximum 340 nm)
![Spektrofotometr fotometrické filtry l Slouží k vymezení určitého co nejužšího pásu monochromatického Spektrofotometr - fotometrické filtry l Slouží k vymezení určitého ( co nejužšího) pásu monochromatického](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-30.jpg)
Spektrofotometr - fotometrické filtry l Slouží k vymezení určitého ( co nejužšího) pásu monochromatického světla ze spojitého záření. l Charakteristikou filtru je tzv. spektrální pološířka filtru (h, nm) - odpovídá intervalu vlnových délek záření v polovině maximální propustnosti filtru (je odvozena z křivky propustnosti). Čím je rozsah pološířky filtru užší, tím je filtr lepší. l Fotometrické filtry dělíme na dvě základní skupiny: barevné absorpční a interferenční
![Spektrofotometr fotometrické filtry Křivka propustnosti transmitance Spektrální pološířka filtru h nm odpovídá Spektrofotometr - fotometrické filtry Křivka propustnosti transmitance Spektrální pološířka filtru (h, nm) - odpovídá](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-31.jpg)
Spektrofotometr - fotometrické filtry Křivka propustnosti transmitance Spektrální pološířka filtru (h, nm) - odpovídá intervalu vlnových délek záření v polovině maximální propustnosti filtru – transmitance, je odvozena z křivky propustnosti). Čím je rozsah pološířky filtru užší, tím je filtr lepší.
![Fotometrické filtry Barevné absorpční filtry mají nižší spektrální čistotu filtrovaného záření jejich pološířka Fotometrické filtry Barevné absorpční filtry - mají nižší spektrální čistotu filtrovaného záření, jejich pološířka](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-32.jpg)
Fotometrické filtry Barevné absorpční filtry - mají nižší spektrální čistotu filtrovaného záření, jejich pološířka je 30 -80 nm l Pevné - skla vyrobená z oxidy kovů, nebo pokrytá vrstvou želatiny s organickým barvivem l Kapalné – obvykle kyvety s roztoky anorganických solí
![Fotometrické filtryinterferenční filtry Interferenční filtry využívají mnohonásobnou interferenci záření mezi hraničními plochami s výbornými Fotometrické filtry-interferenční filtry Interferenční filtry využívají mnohonásobnou interferenci záření mezi hraničními plochami s výbornými](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-33.jpg)
Fotometrické filtry-interferenční filtry Interferenční filtry využívají mnohonásobnou interferenci záření mezi hraničními plochami s výbornými odrazovými vlastnostmi, mají užší šířku pásma a vyšší pík transmitance (lepší propustnost) než barevné absorpční filtry. Nejvíce rozšířený je kovový Fabry-Perotův filtr. a, c – polopropustné vrstvičky b – vrstva dielektrika o tloušťce /2 d, e – krycí vrstvy
![Spektrofotometr monochromátory Optická zařízení pomocí kterých se ze spektra polychromatického světla mechanicky vymezí Spektrofotometr - monochromátory Optická zařízení pomocí kterých se ze spektra polychromatického světla mechanicky vymezí](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-34.jpg)
Spektrofotometr - monochromátory Optická zařízení pomocí kterých se ze spektra polychromatického světla mechanicky vymezí pouze jeho určitá část. Slouží pro kontinuální výběr různých vlnových délek
![Monochromátor se skládá l vstupní štěrbiny l pomocné optiky zrcadla čočky l disperzního prvku Monochromátor se skládá: l vstupní štěrbiny l pomocné optiky (zrcadla, čočky) l disperzního prvku](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-35.jpg)
Monochromátor se skládá: l vstupní štěrbiny l pomocné optiky (zrcadla, čočky) l disperzního prvku - mřížka, hranol l výstupní štěrbiny
![Monochromátor vstupní a výstupní štěrbina Vstupní vymezuje malou část světelného toku ze zdroje Monochromátor- vstupní a výstupní štěrbina Vstupní – vymezuje malou část světelného toku ze zdroje](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-36.jpg)
Monochromátor- vstupní a výstupní štěrbina Vstupní – vymezuje malou část světelného toku ze zdroje záření Výstupní štěrbina – slouží k výběru záření určité vlnové délky, čím je užší tím užší je šířka pásma (bandpass) a větší monochromatičnost záření. Poloha štěrbin je neměnitelná, požadovaná vlnová délka se nastavuje přímým otáčením disperzního prvku.
![Monochromátor pomocná optika Zrcadla jsou to plochy odrážející záření jsou potažena obvykle Monochromátor - pomocná optika Zrcadla - jsou to plochy odrážející záření, jsou potažena obvykle](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-37.jpg)
Monochromátor - pomocná optika Zrcadla - jsou to plochy odrážející záření, jsou potažena obvykle vrstvou hliníku • Rovinná – nejvíce používaná • Dutá, kulová , parabolická Čočky – optický zaostřovací systém Optická vlákna – skleněná, křemenná usměrňují transport světla ve stísněných prostorách (vertikální fotometry k měření mikrotitračních destiček), mají větší světelné ztráty než zrcadla Clony – používají se k omezení průřezu svazku paprsků, k odstínění okrajové oblasti čoček a zrcadel
![Disperzní prvek optický hranol l rozkládá polychromatické světlo na principu lomu světla l Disperzní prvek - optický hranol l rozkládá polychromatické světlo na principu lomu světla l](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-38.jpg)
Disperzní prvek - optický hranol l rozkládá polychromatické světlo na principu lomu světla l světelné paprsky o kratší vlnové délce (modré světlo) se lámou více než paprsky s delší vlnovou délkou l Skleněný hranol - pro rozklad světla ve VIS oblasti spektra (400 -800 nm) l Křemenný hranol – pro UV oblast (do 200 nm)
![Disperzní prvek difrakční reflexní mřížka l pracuje na principu odrazu světla l Je Disperzní prvek – difrakční reflexní mřížka l pracuje na principu odrazu světla l Je](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-39.jpg)
Disperzní prvek – difrakční reflexní mřížka l pracuje na principu odrazu světla l Je tvořena soustavou jemných rovnoběžných vrypů na skleněné destičce (nejkvalitnější až 1700 /1 mm) l Na vybroušených ploškách mřížky dochází k složitým optickým procesům-odraz, interference světla, které vedou k tomu, že z mřížky vychází jednotlivé vlnové délky pod rozdílným úhlem, který závisí na vlnové délce záření l Rozklad záření je lineární u všech vlnových délek l Má lepší rozlišovací schopnost než hranol
![Výběr požadované vlnové délky Přesným pohybem disperzního prvku monochromátoru je vzniklé světelné spektrum Výběr požadované vlnové délky ☼ Přesným pohybem disperzního prvku monochromátoru je vzniklé světelné spektrum](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-40.jpg)
Výběr požadované vlnové délky ☼ Přesným pohybem disperzního prvku monochromátoru je vzniklé světelné spektrum nasměrováno na výstupní štěrbinu tak, aby jím prošlo záření požadované vlnové délky
![kyveta difrakční reflexní mřížka detektor mikrometrický šroub zdroj světla optické zrcadlo kyveta difrakční reflexní mřížka detektor mikrometrický šroub zdroj světla optické zrcadlo](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-41.jpg)
kyveta difrakční reflexní mřížka detektor mikrometrický šroub zdroj světla optické zrcadlo
![Spektrofotometr Absorpční prostředí Kyveta s měřeným vzorkem Rozdělení l dle velikosti Makro 1 Spektrofotometr - Absorpční prostředí Kyveta s měřeným vzorkem Rozdělení: l dle velikosti: Makro- (1](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-42.jpg)
Spektrofotometr - Absorpční prostředí Kyveta s měřeným vzorkem Rozdělení: l dle velikosti: Makro- (1 -2 ml), semimikro- (<0, 5 ml), mikro-(<100 μl) l dle typu: nalévací, průtokové l dle materiálu: skleněné, plastové (akrylátové, polystyrenové), křemenné (UV oblast) l automatických bioch. analyzátorech: • kyvety na jedno použití • trvalé – po změření se promyjí mycí stanicí
![Absorpční prostředí spektrofotometru zatavené kyvety z plastické fólie 400 µl 150 µl 80 µl Absorpční prostředí spektrofotometru zatavené kyvety z plastické fólie 400 µl 150 µl 80 µl](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-43.jpg)
Absorpční prostředí spektrofotometru zatavené kyvety z plastické fólie 400 µl 150 µl 80 µl postup miniaturizace kyvet
![Spektrofotometr detekční systém Je složen z detektoru záření a elektronického zařízení pro zpracování Spektrofotometr - detekční systém Je složen z detektoru záření a elektronického zařízení pro zpracování](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-44.jpg)
Spektrofotometr - detekční systém Je složen z detektoru záření a elektronického zařízení pro zpracování jeho odezvy Detektory Zařízení, které zprostředkovávají přeměnu energie záření na jinou formu – obvykle fotochemickou, elektrickou l l Hradlový selenový fotočlánek Fotodioda Fotonásobič Detektor diodového pole
![Detektor hradlový selenový fotočlánek l Skládá se z polopropustné vrstvy stříbra nanesené na Detektor – hradlový selenový fotočlánek l Skládá se z polopropustné vrstvy stříbra nanesené na](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-45.jpg)
Detektor – hradlový selenový fotočlánek l Skládá se z polopropustné vrstvy stříbra nanesené na vrstvě selenu (polovodič) na kovovém podkladě l Světelné záření o vlnové délce λ dopadající na polovodič působí uvolnění elektronů, které přecházejí do vrstvičky stříbra l Tím vzniká elektrický proud, který je proporcionální intenzitě světelného záření
![Detektor fotodioda fotonka Pracuje na principu fotoelektrického efektu l Skládá se z fotosenzitivní Detektor – fotodioda (fotonka) Pracuje na principu fotoelektrického efektu l Skládá se z fotosenzitivní](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-46.jpg)
Detektor – fotodioda (fotonka) Pracuje na principu fotoelektrického efektu l Skládá se z fotosenzitivní katody (obsahuje Ag a různé alkalické kovy a jejich oxidy) a anody umístěné ve vakuu l Fotokatoda uvolňuje při ozáření světlem elektrony, které jsou přitahovány anodou čímž vzniká el. proud, který je proporcionální intenzitě světelného záření
![Detektor fotonásobič Elektrony z fotokatody jsou postupně přitahovány k sérii dynod na Detektor - fotonásobič • Elektrony z fotokatody jsou postupně přitahovány k sérii dynod, na](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-47.jpg)
Detektor - fotonásobič • Elektrony z fotokatody jsou postupně přitahovány k sérii dynod, na které je vloženo postupně se zvyšující napětí • Když elektron narazí na dynodu uvolní z ní mnohem více elektronů, které jsou přitahovány k další dynodě • Obsahuje až 10 dynod, z nichž každá následující má až o 50 V vyšší napětí • Toto vnitřní zesílení signálu umožňuje převést i velmi slabé světelné záření na měřitelné hodnoty elektrického proudu
![Detektor fotonásobič Detektor - fotonásobič](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-48.jpg)
Detektor - fotonásobič
![Detektor s diodovým polem l Je tvořen velkých množstvím miniaturních fotodiod na malé ploše Detektor s diodovým polem l Je tvořen velkých množstvím miniaturních fotodiod na malé ploše](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-49.jpg)
Detektor s diodovým polem l Je tvořen velkých množstvím miniaturních fotodiod na malé ploše destičky, na kterou dopadá světelné záření po průchodu absorpčním prostředím a následně je rozložené monochromátorem na jednotlivé vlnové délky
![Detektor s diodovým polem Rozdíl oproti klasickému spektrofotometru monochromátor je umístěn až Detektor s diodovým polem • Rozdíl oproti klasickému spektrofotometru – monochromátor je umístěn až](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-50.jpg)
Detektor s diodovým polem • Rozdíl oproti klasickému spektrofotometru – monochromátor je umístěn až za kyvetou se vzorkem • Použití : v HPLC (UV/VIS detektor), automatické biochemické analyzátory • Usnadňuje tzv. bichromatické měření absorbance
![Konstrukce spektrofotomeru Jednopaprskové Umožňují měřit absorbanci pouze v jednom absorpčním prostředí tj v kyvetě Konstrukce spektrofotomeru Jednopaprskové Umožňují měřit absorbanci pouze v jednom absorpčním prostředí (tj. v kyvetě](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-51.jpg)
Konstrukce spektrofotomeru Jednopaprskové Umožňují měřit absorbanci pouze v jednom absorpčním prostředí (tj. v kyvetě s měřeným vzorkem nebo v kyvetě s blankem) l Zdroj světla l Vstupní štěrbina l Monochromátor l Výstupní štěrbina l Kyveta l detektor
![Konstrukce spektrofotomeru Dvoupaprskový Dvě základní konstrukční řešení l Paprsek určité vlnové délky z monochromátoru Konstrukce spektrofotomeru Dvoupaprskový Dvě základní konstrukční řešení: l Paprsek určité vlnové délky z monochromátoru](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-52.jpg)
Konstrukce spektrofotomeru Dvoupaprskový Dvě základní konstrukční řešení: l Paprsek určité vlnové délky z monochromátoru je rozdělen na dvě části, jedna polovina prochází kyvetou se vzorkem, druhá s kyvetou s blankem – vyžaduje 2 detektory l Paprsek vycházející z monochromátoru je rotujícím zrcadlem střídavě usměrňován na kyvetu se vzorkem a směrován na jeden společný fotonásobič
![Blank M Vzorek M Blank Vzorek Blank ☼ M < Vzorek ☼ M Blank Vzorek](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-53.jpg)
Blank ☼ M < Vzorek ☼ M Blank Vzorek
![Kontrola kvality spektrofotometru Přesnost nastavené vlnové délky Ověřuje že vlnová délka nastavená na přístroji Kontrola kvality spektrofotometru Přesnost nastavené vlnové délky Ověřuje, že vlnová délka nastavená na přístroji](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-54.jpg)
Kontrola kvality spektrofotometru Přesnost nastavené vlnové délky Ověřuje, že vlnová délka nastavená na přístroji odpovídá skutečné vlnové délce procházejí měřeným vzorkem. l Použití rtuťové výbojky (ostré čárové spektrum) l Použití absorpčních filtrů (z kysličníku holmia) s přesně definovaným absorpčním pruhem – filtr je přístrojem naskenován a zjištěný absorpční pík je srovnán se známým píkem. Povolená tolerance je ± 1 -2 nm.
![Kontrola kvality spektrofotometru Rozptýlené světlo Světlo které může dopadnout na detektor aniž by prošlo Kontrola kvality spektrofotometru Rozptýlené světlo Světlo, které může dopadnout na detektor aniž by prošlo](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-55.jpg)
Kontrola kvality spektrofotometru Rozptýlené světlo Světlo, které může dopadnout na detektor aniž by prošlo měřeným vzorkem (př. nedokonalé odstínění optického systému spektrofotometru) l Ověřuje se vložením neprůsvitného bloku do nosiče kyvety a sledováním odezvy detektoru Drift signálu Schopnost detektoru udržovat konstantní hodnotu l Sledování nulové linie
![Vertikální fotometrie Vertikální fotometrie](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-56.jpg)
Vertikální fotometrie
![Vertikální fotometrie l Spektrofotometrická metoda s uspořádáním kdy světelný paprsek prochází optickým prostředím ve Vertikální fotometrie l Spektrofotometrická metoda, s uspořádáním kdy světelný paprsek prochází optickým prostředím ve](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-57.jpg)
Vertikální fotometrie l Spektrofotometrická metoda, s uspořádáním kdy světelný paprsek prochází optickým prostředím ve vertikálním směru Využití : proměření absorbance v jamkách mikrotitračních destiček, které se používají hlavně pro imunochemická stanovení na principu ELISA (analýzy s navázaným enzymem za využití imunosorbce)
![ELISA Technická instrumentace Provádí se ve speciálních nádobkách uspořádaných do tzv mikrotitračních destiček ELISA - Technická instrumentace Provádí se ve speciálních nádobkách uspořádaných do tzv. mikrotitračních destiček.](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-58.jpg)
ELISA - Technická instrumentace Provádí se ve speciálních nádobkách uspořádaných do tzv. mikrotitračních destiček. Každá destička obsahuje 96 jamek uspořádaných ve 12 řadách po 8 jamkách.
![ELISA Technická instrumentace Pro měření výsledného produktu detekční reakce se používají speciální vertikální ELISA - Technická instrumentace Pro měření výsledného produktu detekční reakce se používají speciální vertikální](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-59.jpg)
ELISA - Technická instrumentace Pro měření výsledného produktu detekční reakce se používají speciální vertikální spektrofotometry - ELISA readry mikrotitračních destiček: je uspořádán tak, že světelný paprsek prochází optickým prostředím ve vertikálním směru.
![ELISA reader vertikální spektrofotometr Princip světelný paprsek ze zdroje prochází přes zvolený interferenční filtr ELISA reader (vertikální spektrofotometr) Princip: světelný paprsek ze zdroje prochází přes zvolený interferenční filtr](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-60.jpg)
ELISA reader (vertikální spektrofotometr) Princip: světelný paprsek ze zdroje prochází přes zvolený interferenční filtr (podle požadované vlnové délky) do optických kabelů, lkteré zabezpečují distribuci do 9 oddělených kanálů: 8 z nich vedou přes jamky mikrotitrační destičky a dopadají na pole fotodiod, které detekují intenzitu světla. l. Devátý optický kabel je použit na kontrolu intenzity záření vycházejícího ze zdroje (obrázek č. 8). l Ve zlomku vteřiny se změří celá řada jamek (8), mikrotitrační destička se posune a může se měřit řada následující.
![ELISA reader vertikální spektrofotometr ELISA reader (vertikální spektrofotometr)](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-61.jpg)
ELISA reader (vertikální spektrofotometr)
![](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-62.jpg)
![ELISA reader vertikální spektrofotometr Součásti vertikálního fotometru l zdroj záření nejčastěji používá halogenová žárovka ELISA reader (vertikální spektrofotometr) Součásti vertikálního fotometru: l zdroj záření: nejčastěji používá halogenová žárovka](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-63.jpg)
ELISA reader (vertikální spektrofotometr) Součásti vertikálního fotometru: l zdroj záření: nejčastěji používá halogenová žárovka nebo xenonová výbojka. l Interferenční filtry: jsou umístěny v posuvném držáku filtrů, obvykle se používá 6 filtrů (pro λ 400 -800 nm). l Optický systém: se skládá 9 optických kabelů (světlovodiče), štěrbin a zrcadel pro vedení světelného paprsku ze zdroje do optického prostředí (jamka mikrotitrační destičky). l Detektor: používají se fotodiody. Rychlost měření je 5 s (celá mikrotitrační destička - 96 jamek).
![Vertikální fotometrie l Vztah mezi změřeným signálem absorpcí a koncentrací se určuje kalibrací Obvykle Vertikální fotometrie l Vztah mezi změřeným signálem (absorpcí) a koncentrací se určuje kalibrací. Obvykle](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-64.jpg)
Vertikální fotometrie l Vztah mezi změřeným signálem (absorpcí) a koncentrací se určuje kalibrací. Obvykle se změří absorbance 6 -ti standardních roztoků o známé vzrůstající koncentraci a blank ( slepý pokus, obsahuje vše kromě stanovované látky) při určité vlnové délce.
![Vertikální fotometrie l Při ELISA metodě se vyžaduje měření všech vzorků v duplikátech l Vertikální fotometrie l Při ELISA metodě se vyžaduje měření všech vzorků v duplikátech. l](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-65.jpg)
Vertikální fotometrie l Při ELISA metodě se vyžaduje měření všech vzorků v duplikátech. l Poté software přístroje sestrojí kalibrační křivku (naměřené hodnoty absorbance standardů na ose y, hodnoty koncentrace na ose x), ze které odečte hodnoty koncentrací neznámých vzorků l Při vertikální fotometrii závisí dosažené výsledky měření pouze na přesnosti pipetování kalibrátorů, kontrolních materiálů a vzorků.
![ELISA automatická linka l Automatická linka provádí l automatické pipetování vzorků reagencií kalibrátorů a ELISA automatická linka l Automatická linka provádí: l automatické pipetování vzorků, reagencií, kalibrátorů a](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-66.jpg)
ELISA automatická linka l Automatická linka provádí: l automatické pipetování vzorků, reagencií, kalibrátorů a kontrol pomocí pipetovacího systému (2, 4, 8 jehel). l Má zabudovanou čtečku čárového kódu, což umožňuje pozitivní identifikaci pacientských vzorků. l Linka má obvykle 3 -4 místa pro umístění mikrotitračních destiček. l Dále sestává z inkubátoru (místo pro inkubaci vzorků), l promývačky a readeru mikrotitračních destiček. l Transport destiček mezi jednotlivými částmi provádí pomocí robotického ramene. S l systém provádí automatické ředění vzorků a je opatřen softwarem pro automatické vyhodnocení měření.
![ELISA automatická linka l Velkou výhodou automatické linky je použití čárových kódů a tím ELISA automatická linka l Velkou výhodou automatické linky je použití čárových kódů, a tím](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-67.jpg)
ELISA automatická linka l Velkou výhodou automatické linky je použití čárových kódů, a tím zabránění záměny mezi vzorky. Dále je to přesnost pipetování vzorků a reagencií, vysoká kapacita přístroje. l Nevýhodou je vyšší spotřeba používaných reagencií.
![Reflexní fotometrie Reflexní fotometrie](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-68.jpg)
Reflexní fotometrie
![Reflexní fotometrie Princip l měření intenzity záření odraženého od neprůhledné homogenně zbarvené podložky Hodnotí Reflexní fotometrie Princip l měření intenzity záření odraženého od neprůhledné (homogenně zbarvené) podložky. Hodnotí](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-69.jpg)
Reflexní fotometrie Princip l měření intenzity záření odraženého od neprůhledné (homogenně zbarvené) podložky. Hodnotí se poměr intenzity dopadajícího světla a světla odraženého od barevné plochy l Použití: suchá chemie, močová analýza, denzitometrické hodnocení tenkovrstevných chromatografů
![Reflexní fotometr l Přístroj slouží ke kvantitativnímu vyhodnocení reakcí probíhajících na pevné fázi Pevná Reflexní fotometr l Přístroj slouží ke kvantitativnímu vyhodnocení reakcí probíhajících na pevné fázi. Pevná](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-70.jpg)
Reflexní fotometr l Přístroj slouží ke kvantitativnímu vyhodnocení reakcí probíhajících na pevné fázi. Pevná fáze slouží jako nosič obsahující činidla aktivovaná vodou obsaženou v naneseném vyšetřovaném biologické materiálu (krev, moč). l Měří se intenzita záření odraženého od homogenně zbarvené podložky. (matrice)
![Reflexní fotometr pevná fáze matrice l Činidla jsou v reagenční zóně proužku impregnována Reflexní fotometr - pevná fáze (matrice) l Činidla jsou v reagenční zóně proužku impregnována](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-71.jpg)
Reflexní fotometr - pevná fáze (matrice) l Činidla jsou v reagenční zóně proužku impregnována vlákna proužku (fy Roche, Reflekton) l Činidla jsou nanesena v reagenční zóně proužku jako vícevrstevný film (fy Kodak)
![Reflexní fotometr Odraz světla od reagenční zóny l zrcadlový na reflexní ploše zrcadla Reflexní fotometr Odraz světla od reagenční zóny: l zrcadlový – na reflexní ploše zrcadla](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-72.jpg)
Reflexní fotometr Odraz světla od reagenční zóny: l zrcadlový – na reflexní ploše zrcadla l difuzní - je výsledkem interakce dopadajícího světla s molekulami reakční zóny (zahrnuje i absorpci a rozptyl)
![Hlavní komponenty reflexního fotometru Zdroj záření l halogenová lampa l xenonová výbojka l světloemitující Hlavní komponenty reflexního fotometru Zdroj záření: l halogenová lampa l xenonová výbojka l světloemitující](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-73.jpg)
Hlavní komponenty reflexního fotometru Zdroj záření: l halogenová lampa l xenonová výbojka l světloemitující dioda
![Hlavní komponenty reflexního fotometru Ulbrichtova koule jako zdroj difuzního světla l dutá koule jejíž Hlavní komponenty reflexního fotometru Ulbrichtova koule (jako zdroj difuzního světla): l dutá koule jejíž](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-74.jpg)
Hlavní komponenty reflexního fotometru Ulbrichtova koule (jako zdroj difuzního světla): l dutá koule jejíž vnitřní povrch je potažen vysoce reflexním materiálem (síran barnatý). l Světlo ze zdroje se po vstupu do koule mnohonásobně odráží od stěn a jako dokonale difuzní dopadá na reagenční plošku
![Hlavní komponenty reflexního fotometru l Detektor záření l uvnitř koule jsou umístěny dva detektory Hlavní komponenty reflexního fotometru l Detektor záření: l uvnitř koule jsou umístěny dva detektory.](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-75.jpg)
Hlavní komponenty reflexního fotometru l Detektor záření: l uvnitř koule jsou umístěny dva detektory. l Jeden měří světlo difuzně odražené od reagenční plošky a druhý je referenční
![](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-76.jpg)
![Děkuji za pozornost Děkuji za pozornost](https://slidetodoc.com/presentation_image/22bea54050c36cd95e1a525a6a83af75/image-77.jpg)
Děkuji za pozornost
Milan pilát
Mgr. petra hovězáková
Mgr luc cyr
Mgr jan kozák
Mgr. dalibor kott
Atribuční chyba
Iprazak
Hannibalov pochod na rim
Mgr family tree
Doktor práv skratka
Contabilidad ingenieria industrial
Mgr
Mgr. pavol hrvol
Mgr. monika havlíčková
Mgr. veronika fuchsová
Mgr z kropką czy bez
Petr beck
Jana schlossarková
Jana šmardová
Zaproszona do białej na pierogi w wierszu jana brzechwy
Laminin cross
Dataflow
Jana švadlenová
Qnline
Jana kazimierza 16
Kas ujep
Królowie elekcyjni drzewo genealogiczne
Jana van greunen
Jana clack
Vevericka vrtka
Jana novotn
Pronalazak vatre
Co to jest podmiot liryczny
Jana belašičová
Jana novotn
Jana crystallography
Discrete cosine transform formula
Siittiön elinikä
Student doctor method of clinical training
Jana kruzliakova
Jana poljak
Jana novotn
Suman jana
Dopravní fakulta jana pernera
Jana novotn
Bohaterowie wierszy jana brzechwy
Jana jakovleva
Wiersz ks. jana twardowskiego
Jana pomyk
Dr suman jana
Jaki jest najkrótszy tren kochanowskiego
Jana kodrič
Prof. jana heimel
Jana kosecka gmu
Jana pohorelsky
Jana pe
Wierszyk o zoo
Jana vermette
Jana petrov knjiga
Jana camara
Jana novotna cancer type
Uionica
Jana feldmane
Jana midelfart hoff
Iv 21 15-19
Historia polski w obrazach jana matejki
Dr suman jana
Jana schmalian
Biografia kochanowskiego
Jana has $100 to open a checking account
Herb papieża franciszka
Jana körber
Jana camara
Researching the corruption
Meniny jana
Jana morela
Jana štrbková
Jsteg