Nukleinsyrer og proteinsyntese Pensum SolomonFryhle kap 25 Pensum

Nukleinsyrer og proteinsyntese Pensum: Solomon&Fryhle kap. 25 Pensum: Hele kapitlet Chapter 25

t Introduksjon èDeoksyribonukleinsyre (DNA) og ribonukleinsyre (RNA) er molekylene som bærer den genetiske informasjonen i cellene DNA er det molekylære arkivet for proteinsyntese H RNA molekyler transkriberer og oversetter informasjonen fra DNA så den kan bli brukt for å styre proteinsyntese H èDNA er sammensatt av to polymer-kjeder som holdes sammen av hydrogenbindinger Dets overordnede struktur er som en vridd stige H Sidene av stigen er alternerende sukker og fosfatgrupper H Trinnene i stigen er hydrogenbundede par av heterosykliske aminbaser H Chapter 25 2

èDNA polymere er svært lange molekyler H DNA er krøllet og pakket inn i 23 kromosomer som igjen er pakket inn i cellekjernen èRekkefølgen av de heterosykliske aminbasene i DNA koder for den genetiske informasjonen som er nødvendig for å syntetisere proteiner Bare 4 forskjellige baser blir brukt for å kode i DNA H En del av DNA som koder for et spesifikt protein kalles et gen H Settet av all genetisk informasjon som kodes av DNA kalles organismens genom H Settet av alle proteiner som blir kodet for i genomet i en organisme og som uttrykkes til en gitt tid er et proteom H èRekkefølgen av det humane genomet gir verdifull informasjon om organismens helse H Eksempel: Et skjematisk kart av gener på kromosom 19 som er knyttet til sykdom Chapter 25 3

t Nukleotider og nukleosider èMild degradering av nukleinsyrer gir monomere enheter kalt nukleotider èVidere hydrolyse av nukleotider gir: En heterosyklisk amin base H D-ribose (fra RNA) eller 2 -deoksyy-D-ribose (fra DNA); begge er C 5 monosakkarider H Et fosfat jon H èDen heterosyliske basen er bundet av en b N-glykosidisk binding til C 1’ av monosakkaridet H Eksempler: En generell struktur av et RNA nukleotid (a) og adenylsyre (b) èEt nukleosid er et nukleotid uten fosfatgruppen H ET nukleosid av DNA inneholder 2 -deoxy-D-ribose og en av de følgende 4 baser Chapter 25 4

èEt nukleosid av RNA inneholder sukkerenheten D-ribose og en av de fire basene adenin, guanin, cytosin eller uracil Chapter 25 5

èNukleosider som finnes i DNA Chapter 25 6

èNukleosider som finnes i RNA Chapter 25 7

èNukleotider kan navngis på mange måter Adenylsyre kalles vanligvis AMP (adenosin monofosfat) H Den kan også kalles adenosin 5’-monofosfat eller 5’-adenylsyre H èAdenosin trifosfat (ATP) er et viktig molekyl som energireservoar èMolekylet 3’, 5’-syklisk adenylsyre (syklisk AMP) er en viktig regulator av hormonaktivitet H Dette molekylet biosyntetiseres fra ATP av enzymet adenylat syklase Chapter 25 8

t Laboratoriesyntese av nukleosider og nukleotider èSilyl-Hilbert-Johnson nukleosidering En N-bensoyl-beskyttet base reagerer med et bensoyl-beskyttet sukker i nærvær av tinnklorid og BSA (et trimethylsilylerings-reagens) H Trimethylsilyl-beskyttelsesgrupper blir fjernet med vandig syre i det andre trinnet H Bensoyl-gruppene kan fjernes med base H Chapter 25 9

èUnaturlige nukleotid-derivater kan syntetiseres fra nukleosider som har en substituerbar gruppe på den heterosykliske ringen Chapter 25 10

èDibensyl fosfokloridat er et fosforyleringsreagens for omdannelse av nukleosider til nukleotider H 5’-OH blir fosforylert selektivt hvis 2’- and 3’-OH gruppene er beskyttet Chapter 25 11

t Deoksyribonukleinsyre: DNA l Primær struktur èMonomer-enhetene, nukleinsyrene er nukleotider H Nukleotidene er bundet sammen med fosfatester bindinger èRyggraden i nukleinsyrer består av alternerende fosfat- og sukkergrupper èHeterosykliske baser er bundet til ryggraden på hver sukkerenhet èRekkefølgen av baser utgjør koden I den genetiske informasjonen èRekkefølgen av baser blir alltid spesifisert fra 5’ enden av nukleinsyren Chapter 25 12

l Sekundær struktur èSekundærstrukturen av DNA ble foreslått av Watson and Crick i 1953 èE. Chargaff bemerket at i DNA var prosentandelen av pyrimidin baser tilnærmet lik prosentandelen av purin baser Molprosenten av adenin er nesten lik den for tymin H Molprosenten av guanin er nesten lik den for cytosin H èChargaff observerte også at forholdet mellom A and T versus G og C varierte mellom artene men forholdet er det samme forskjellig vev i den samme organismen Chapter 25 13

èRøntgen krystallografiske data viste bindingslengder og vinkler for purin og pyrimidin baser H Røntgen data viste også at DNA hadde en lang repetisjons-avstand (34 Å) èBasert på disse data, foreslo Watson og Crick den doble heliks modellen for DNA (neste side) H H H To nukleinsyre-kjeder holdes sammen ved hydrogenbindinger mellom basene i motstående kjede Dobbel-kjeden er tvunnet som en heliks Hver sving i heliksen er 34Å lang og involverer 10 suksessive nukleotid-par Hvert basepar må involvere en purin og en pyrimidin for å oppnå riktig avstand mellom sukker-fosfat ryggraden Base-paring kan forekomme bare mellom tymin og adenin, eller cytosin og guanin; T – A og C – G ingen andre paringer har det optimale mønster av hydrogenbinding eller ville tillate at avstanden mellom sukker-fosfat ryggraden å bli regelmessig Chapter 25 14

Chapter 25 15

èSpesifikk paring av baser betyr at de to kjeder av DNA er komplementære H Hvis man kjenner rekkefølgen av en kjede, kjenner man også rekkefølgen av den andre kjeden Chapter 25 16

l Replikasjon av DNA (se neste side) èDNA kjeden begynner å folde seg ut like før celledeling èKomplementære kjeder dannes langs hver kjede (vi sier at hver kjede fungerer som et templat for en ny kjede) èTo nye DNA molekyler er resultatet; en kjede går til hver dattercelle Chapter 25 17

Chapter 25 18

t RNA og proteinsyntese è“The central dogma of molecular genetics” èEt gen er den del av et DNA molekyl som koder for ett protein H Proteiner har mange kritiske funksjoner, f. eks. katalyse, struktur, bevegelse, cellesignalering, immunrespons osv. èDNA befinner seg i cellekjernen og proteinsyntese skjer i cytoplasma Transkripsjon av DNA til messenger RNA (m. RNA) skjer i kjernen H m. RNA diffunderer til cytoplasma og det skjer en translasjon til proteiner ved hjelp av to andre former for RNA: ribosomalt RNA (r. RNA) og transfer RNA (t. RNA) H Chapter 25 19

l Transkripsjon: Syntese av Messenger RNA (m. RNA) èI kjernen blir et DNA molekyl delvis “pakket ut” for å eksponere en del korresponderende til minst ett gen èRibonukleotider med komplementære baser samler seg langs DNA enkeltkjeden Base-paring er den samme i RNA, bortsett fra at i RNA tymin erstattet av uracil H Ribonukleotider blir koblet til en kjede av m. RNA av enzymet RNA polymerase H Chapter 25 20

èEt intron (intervening sequence) er et segment av DNA som blir transkribert til m. RNA men blir ikke brukt til noe når et protein blir uttrykt èEt exon (expressed sequence) er et segment i DNA genet som blir uttrykt èHvert gen inneholder vanligvis mange introner og exoner H Introner blir utskilt fra m. RNA etter transkripsjon Chapter 25 21

l Ribosomer - r. RNA èProtein syntese blir katalysert i cytoplasma av ribosomer Et ribosom består av tilnærmet 2/3 av RNA og 1/3 protein H Et ribosom er et ribozym (en reaksjons-katalysator, eller enzym som består av ribonukleinsyre) H èEt ribosom har 2 store under-enheter 30 S under-enheten binder m. RNA som koder for proteinet som skal oversettes H 50 S under-enheten katalyserer dannelse av amidbindingen i proteinsyntesen H èOverføring av en aminosyre til den voksende peptidkjeden blir hjulpet av syre-base katalyse som involverer et adenin i 50 S under -enheten èSe figur 25. 14, side 1238 (Den mekanismen skal ikke pugges) Chapter 25 22

l Transfer RNA (t. RNA) èTransfer RNA (t. RNA), som er spesifikk for hver aminosyre, transporterer aminosyrer til komplementære bindingssteder på m. RNA som er bundet til ribosomet H Mer enn ett t. RNA koder for hver aminosyre èt. RNA er sammensatt av et relativt lite antall nukleotider hvis kjede er foldet til en struktur med flere looper En arm av t. RNA avslutter alltid i sekvensen cytosin-adenin, og det er her aminsyren blir tilknyttet H PÅ en annen arm blir en rekke av tre baser kalt anticodon, som binder seg til det komplementære codon på m. RNA H èDen genetiske koden for m. RNA er vist på neste side èStrukturen på et t. RNA molekyl er vist i fig. 25. 15, på side 1240 Chapter 25 23

l Transfer RNA (t. RNA) Chapter 25 24

Chapter 25 25

l Den genetiske kode èDen genetiske kode er basert på tre-base rekkefølger i m. RNA èHver tre-base rekkefølge korresponderer til en spesiell aminosyre Det faktum at tre baser brukes for å kode for hver aminosyre gir unikhet i den overordnede koden og i start og stoppsignaler H N-formyl metionin (f. Met) er den første aminosyren som bygges inn i bakterielt protein og synes å være start signalet H f. Met blir fjernet fra proteinkjeden før dets syntese er fullført H Chapter 25 26

l Oversettelse (translation) èOversettelse er rett og slett peptidsyntese ved hjelp av et ribosom ved å bruke en kode fra et m. RNA èFølgende trinn er et eksempel (se figur på neste side): H H H H H Et m. RNA binder seg til et ribosom Et t. RNA med anticodonet for f. Met binder seg til f. Met codonet på m. RNA Et t. RNA med anticodon UUU bringer et lysin residu til AAA m. RNA codonet 50 S ribosomet katalyserer dannelse av amidbinding mellom f. MET og lysin Ribosomet beveger seg nedover m. RNA-kjeden til det neste codonet (GUA) Et t. RNA med anticodon CAU bringer et valin residu Ribosomet katalyserer amidbinding mellom lysin og valin Ribosomet beveger seg nedover langs m. RNA-kjeden og prosessen fortsetter, f. eks. med t. RNA for fenylalanin-binding til ribosomet Et stoppsignal nåes og ribosomet separeres fra m. RNA På dette tidspunktet separeres også polypeptidet også fra ribosomet èPolypeptidet begynner å innta sin sekundære og primære struktur mens det blir syntetisert èMange ribosomer kan oversette det samme m. RNA molekylet samtidig èProteinmolekylet syntetiseres bare når det er behov for det H Regulatormolekyler bestemmer når og hvis et spesielt protein blir uttrykt, dvs. syntetisert Chapter 25 27

Chapter 25 28

l Bestemmelse av baserekkefølgen i DNA èKjede-termineringsmetoden (Dideoksynukleotide) DNA molekyler blir kopiert på en slik måte at en serie av delvise kopier blir generert; hver DNA-kopi er forskjellige i lengde bare med en base H Tilfeldig kjede-terminering blir gjort ved å “forgifte” en kopieringsreaksjon med en lav konsentrasjon av 2’ 3’-dideoxynucleotides – (mangler den 3’-OH-gruppen som normalt danner binding til neste nukleotid) H Kjede forlengelse blir umulig ved deres 3’posisjon H 2’ 3’-dideoksynucleotidenemerkes med kovalent tilknyttet fluorescens fargestoffer, med hver farge representer sin basetype H De delvise kopiene blir så separert i henhold til lengde på kjeden ved kapillærelektroforese H Den terminale basen på hver DNA enkeltkjede blir så detektert ved sin spesifikke farge ved laser-indusert fluorescens når hver enkelt DNA passerer detektoren H Et 4 -fargers kromatogram blir generert (se figur 25. 17, side 1246) H Chapter 25 29

èAutomatisering av “high-throughput ‘dideoxy’” sekvensbestemmelse muliggjorde fullføringen av Det Humane Genom Prosjektet ved 50 -års feiringen av Watson og Crick’s utledning av strukturen til DNA i 2003 Chapter 25 30

l Laboratoriesyntese av DNA èFastfase metoder for laboratoriesyntese av DNA likner på de som brukes for laboratoriesyntese av proteiner Fastfasen er ofte glass med kontrollert porestørrelse (CPG) H Beskyttelse/blokkeringsreagenser er nødvendig (f. eks. dimetoksytrityl og bcyanoetyl grupper) H Et koblingsreagens (1, 2, 3, 4 -tetrazol) brukes for å knytte sammen de beskyttede nukleotider H Chapter 25 31

Chapter 25 32

l Polymerase kjedereaksjon (PCR) èPCR er en ekstremt enkel og effektiv metode for å eksponentielt multiplisere (forsterke) antall kopier av et DNA molekyl. PCR kan begynne med et molekyl og gi 100 milliarder kopier på en kveld H Nobelprisen ble gitt til K. Mullis i 1993 for PCR oppfinnelsen H èPCR trenger: H H H En prøve av det DNA som skal kopieres Enzymet DNA polymerase En kort ‘primer’ kjede komplementær til templat DNAet Et forråd av A, C, G, og T nukleotid trifosfat monomere Et enkelt apparat for termisk kontroll under reaksjons sekvensen èPCR prosessen kan oppsummeres som vist på de neste 2 sidene Chapter 25 33

Chapter 25 34

Chapter 25 35