ENDSTRYEL GENETIK Danman Do Dr Aslhan KURT KIZILDOAN

ENDÜSTRİYEL GENETIK Danışman: Doç. Dr. Aslıhan KURT KIZILDOĞAN Ayşenur Efşan YARAR

Mikrobiyal Metabolizma § Metabolizma, hücrenin enzimler tarafından katalizlenen tüm reaksiyonlarını kapsamaktadır. Bu reaksiyon işlemleri birincil ve ikincil olarak ikiye ayrılabilir. • Birincil metabolik yol, çoğu mikroorganizmada büyük ölçüde ortaktır. Bu metabolik yollar, katabolizma olarak adlandırılan enerji üreten metabolizmalarda ve bu enerjiden yararlanılarak, anabolizma olarak adlandırılan canlılığın korunması için gerekli hücresel bileşenlerin biyosentezinde yer almaktadır. • Bazı mikroorganizmalarda ikincil metabolizma da gerçekleşmektedir. Bu metabolizmadaki metabolik yollar hızlı gelişim sırasında kullanılmamaktadır. İkincil metabolizma ürünleri farklı ve genellikle türe özgü son ürünlerdir 2

Katabolizma • Tüm vejetatif mikrobiyal hücreler gelişimleri, transferleri, hareketleri ve canlı kalabilmeleri için devamlı bir enerji kaynağına gerek duymaktadır. • Yıkım metabolizması ile potansiyel enerji üretimi ATP, NADH, NADPH ve FADH 2 gibi indirgenmiş koenzimler formunda ve ısı enerjisi olarak gerçekleştirilmektedir. 3

Mikroorganizmalar ATP ve indirgenmiş koenzim oluşturmak için çok farklı metabolizmalara sahiptirler ve bu olaylar sonucunda çoğu zaman hücresel bileşenlerin biyosentezi için öncül maddeler sağlanmaktadır. Glukozdan enerji üretimi, glukozun fosforilasyonu ile başlayıp, ilk olarak ve çoğunlukla da pirüvata oksidasyonu ile devam eder. Glukozun pirüvata metabolize olması yaygın şekilde glikoliz olarak adlandırlır ve bu metabolizma ile ATP, öncül maddeler ve indirgenme enerjisi sağlanır. 4

Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) Metabolik Yolu En yaygın yol olup, ipliksi mantarlar mayalar ve pek çok bakteri dahil, başlıca tüm organizma gruplarında bulunmaktadır. Bu metabolik yol, sitoplazmik matrikste enzimlerle katalizlenen 10 reaksiyon dizisinden meydana gelmekte olup aerobik ve anaerobik koşullar altında çalışabilmektedir. Bu yolun üç kilit regülatör enzimi geri dönüşümsüz olarak rol oynamaktadır. 5

6

Pentoz fosfat (PP) Metabolik Yolu veya Heksoz Monofosfat Metabolik Yolu § Pek çok bakteride ve ökaryotik organizmaların büyük çoğunluğunda bulunmaktadır. • Bu metabolik yol, EMP yolu ile çoğu zaman aynı anda çalışır. • PP metabolik yolu fonksiyonları, aerobik ve anaerobik koşullar altında hem katabolik hem de anabolik rollere sahiptir. 7

8

• Bu yol, anabolik işlemler sırasında esasen indirgeyici aşamalarda kullanılmak üzere NADPH’ın; aromatik aminoasit sentezi için özellikle de riboz olmak üzere pentozların; ve diğer biyosentetik ara ürünlerin sağlanmasında önemlidir. • Ksiloz gibi pentoz şekerlerde bu yol ile katabolize edilebilmektedir. • PP metabolik yolu bir döngüdür ve tüm glikolitik yollar gibi, bu yolun enzimleri de sitoplazmik matrikse yerleşmiştir. 9

Entner-Doudoroff (ED) Metabolik Yolu EMP metabolik yolundan yoksun olan nispeten daha az sayıdaki mikroorganizma tarafından kullanılır. Bu organizmaların büyük çoğunluğu Azotabacter, Pseudomonas, Rhizobium, Xanthomonas ve Zymomonas cinsleri dahil olmak üzere gram-negatif bakterileri içermektedir. Fakat nadiren mantarlarda da bulunur. Bu metabolik yol, PP yolunda olduğu gibi 6 -fosfoglukonatın dönüşümü ile başlar. Fakat bunun ardından okside olmak yerine, dehidre olarak 2 -okso-3 -deoksi-6 -fosfoglukonatı oluşturur. Sonuç olarak, bu metabolik yol ile metabolize edilen her bir glukoz molekülünden iki pirüvat molekülü, bir ATP, bir NADH ve bir NADPH üretilir. EMP metabolik yoluna göre, enerji verimi daha düşüktür. 10

11

Fosfoketolaz (PK) metabolik yolu veya Warburg. Dickens Metabolik Yolu Başta Lactobacillus ve Leuconostoc cinsleri olmak üzere bazı laktik asit bakterileri tarafından kullanılır. Bu yol, PP metabolik yolunda olduğu gibi, glukoz 6 -fosfatın Ru. MP'a. oksidasyonu ve dekarboksilasyonunu kapsamaktadır. Bu metabolik yol, EMP yolu ile karşılaştırıldığında onun yarısı kadar verimle ATP üretmektedir fakat EMP, nükleik asit sentezi için, heksoz şekerlerden pentoz oluşumuna ve pentozların katabolizmasına olanak sağlamamaktadır. 12

13

Trikarboksilik Asit Döngüsü Pirüvat aerobik koşullar altında, birçok bakteri, maya, ipliksi mantar, alg ve protozoada daha ileri düzeyde kullanılarak trikarboksilik asit (TCA) döngüsüne yönlendirilmektedir. TCA döngüsü enzimleri, prokaryotlarda sitoplazmik matrikste iken ökaryotlarda mitokondriyal matrikste bulunmaktadır. Döngüden bir önceki aşamada, pirüvat dehidrogenaz multienzim kompleksi tarafından katalizlenen, pirüvatın oksidatif dekarboksilasyonu ile iki karbonlu (C 2) asetil koenzim A (asetil Co. A) oluşmaktadır. Ayrıca asetil Co. A, bazı mikroorganizmaların yararlanabileceği şekilde, lipitlerin ve bazı aminoasitlerin yıkımlanması ve alkanların oksidasyonu ile elde edilebilir. 14

Katabolizma açısından, TCA döngüsü NADH ve FADH üretmek üzere elektron taşıyıcılarını da indirgemektedir. Bu indirgenmiş koenzimler solunumda ileri aşamalardaki ATP sentezi için kullanılabilir ve böylece ileri katabolizmaya katılmak için yeniden okside olmaktadırlar. TCA döngüsü sadece katabolik yol değildir. Aynı zamanda aminoasitlerin, pürinlerin ve pirimidinlerin biyosentezi için, dört ve beş karbonlu (C 4 ve C 5) ara ürünleri de sağlamaktadır. Biyosentez için çeşitli ara ürünlerin gerekmesi nedeniyle TCA döngüsü dallanmış biyosentetik bir yol olarak faaliyet gösterebilir. Bu şekilde biyosentetik ara ürünleri üretme kolaylığı, aynı zamanda TCA döngüsünün tamamını gerçekleştiremeyen mikroorganizmalarda da gözlenmektedir. 15

Solunum ile NADH ve FADH 2’nin oksidasyonu sonucu daha fazla ATP üretimi sağlanmaktadır. Son elektron alıcısı olarak, oksijen veya bazı fakültatif ya da obligat anaerobik prokaryotlarda olduğu gibi düşük redoks potansiyiline sahip diğer bileşen veya iyonlar gerekmektedir. Oksijen, düşük redoks potansiyiline sahip olduğu ve suya indirgendiği için bu durumda oldukça idealdir. Fakat anaerobik solunumun son ürünlerinden bazıları (nitratın indirgenmesi gibi oluşan nitrit gibi) toksiktir. 16

• Elektronları ve protonları (H+), oksijen veya alternatif son elektron alıcınsa transfer etmek için, ekektron taşıma sistemini (ETS) oluşturan özel, bir dizi ara elektron taşıyıcıları gerekir. • Bu elektron taşıma sistemi, prokaryotlarda sitoplazmik membranın içine bağlı iken, ökaryotlarda mitokondriyal membranın iç kısmına yerleşmiştir. • İlgili ETS reaksiyonları, çözünen madde taşınması gibi enerji gerektiren işlemlere veya oksidatif fosforilasyon ile ATP üretimine bağlanabilir. 17

Oksijenli Solunum Zorunlu aerob ve fakültatif anaerob mikroorganizmalara tarafından oksijen varlığında gerçekleştirilir. Elektronlar, ETS'ye özellikle NADH ve FADH 2 gibi taşıyıcılar ile dahil olurlar. Protonlar membranın içinden dışına hareket ederken, elektronlar membranda taşıyıcılar boyunca ilerlemektedir. Son olarak, su molekülü oluşturmak üzere oksijene tutunurlar. Ökaryotlarda, mitokondriyal membranın içinde bulu-nan ETS, bir NADH ile üç ATP molekülü üretmekte ve aşağıdaki elektron taşıyıcı zincirinden oluşmaktadır. 18

Nitrat Solunumu Fakültatif anaerobik bakteriler ta-rafından gerçekleştirilmektedir. Oksijenin redoks potansiyeli +0. 82 volt iken, nitratın redoks potansiyeli +0. 42 volttur. Bu nedenle son elektron alıcısı olarak oksijene göre daha az enerji kazanılır ve daha az ATP molekülü elde edilir. Bu işlem, nitratın nitrit ve nitrik oksit üzerinden son olarak dinitrojene indirgendiği birkaç basamakta gerçekleşebilir ve disimilatif (tüketimli) nitrat indirgenmesi ya da denitrifikasyon 19

Karbonat Solunumu Methanococcus ve Methanobacterium gibi arkeler (arkealar) tarafından gerçekleştirilir. Bu organizmalar CO 2 ve bazen karbon monoksiti metana indirgeyen zorunlu anaeroblardır. Bu metanojenik bakteriler çoğunlukla, hidrojeni enerji kaynağı olarak kullanır ve bazı hayvanların bağırsakları, bataklıklar, pirinç tarlaları, kanalizasyon ve arıtma sistemleri gibi oksijensiz, nitrat ve sülfatın düşük seviyede olduğu ortamlarda bulunurlar. 20

Fermentasyonlar Organizmalar, solunum seçeneği olmadığı zaman, glukozun pirüvata oksidasyonu sırasında indirgenen, sınırlı koenzim desteğinin yenilenmesi için, alternatif mekanizmalar kullanmalıdır. Fermentasyonlarda son elektron alıcısı olarak pirüvat veya türevleri olan organik moleküller kullanılır. Dolayısıyla NAD(P)+ yeniden üretilerek, katabolizmanın devam etmesi sağlanır. Bununla birlikte, ATP üretimi çok az miktarda olduğundan ya da hiç olmadığından, glukozdan potansiyel enerjinin geri kazanımı açısından bu işlemde kayıp oldukça fazladır. Buna karşın, solunum sırasında oksidatif fermentasyonla birlikte, CO 2'ye eksiksiz oksidasyon sonucu bir glukozdan 36 ATP molekülü üretilebilir. 21

Alkol Fermentasyonu Mayalar ve bazı ipliksi mantarlar tarafından gerçekleştirilir. İki aşamadan oluşan bu işlemde, EMP metabolik yolundan ya da Zymomonas cinsinde olduğu gibi ED metabolik yolundan piruvat, dekarboksilasyon ile asetaldehite dönüşür; ardından etanolün asetaldehite indirgenmesi sırasında NAD+ yeniden oluşturulur. Laktik asit fermentasyonu, bazı mantar, alg ve protozoalarla birlikte, Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus ve Leuconostoc’un dahil olduğu bazı bakteriler tarafından gerçekleştirilir. Burada pirüvat türevlerinden daha çok pirüvatın kendisi son elektron alıcısı olarak görev alır ve laktatı oluşturur. Bu fermentasyonun iki şekli vardır. 22

1. Homolaktik fermentasyon, Lactobacillus acidophilus ve Lactobacillus casei gibi bakteriler tarafından gerçekleştirilir; ve bu fermentasyonla glikoliz ile üretilen pirüvatın neredeyse tamamı laktik asite indirgenir. Homolaktik fermentasyon, ayrıca oksijensiz kalmış hayvan kaslarında da meydana gelmektedir. 2. Heterolaktik fermentasyon ile, laktik asit birlikte farklı ürünler de üretilir. Bu fermentasyonu gerçekleştiren organizmalar, Leuconostoc mesenteroides ve Lactobacillus brevis dahil PK metabolik yolunu kullanan organizmalardır. Pirüvattan laktat, asetil fosfattan etanol elde ederler ve bazı durumlarda asetat da üretebilirler. 23

Karışık asit fermentasyonu E. coli ve benzer falkütatif anaeroblar tarafından gerçekleştirilir. Oluşan ürünler laktat, asetat, az miktarda etanol ve formattır. Bazı mikroorganizmalar formatı hidrojen ve CO 2’ye indirgeme yeteneğine sahiptir. 2, 3 -Bütandiol fermentasyonu Enterobacter, Erwinia, Klebsiella ve Serratia tarafından yapılmaktadır. Karışık asit fermentasyonuna benzerdir fakat etanol ve asitlerle birlikte bütandiol de üretilmektedir. Propiyonik asit fermentasyonu, Propionibacterium cinsi gibi, bazı bağırsak bakterileri tarafından gerçekleştirilmektedir. Burada pirüvat, okzaloasetata karboksile olur ve ardından malat, fumarat ve süksinat üzerinden propiyanata indirgenir. Bu işlem önemli kofaktörleri, biotin, Co. A ve Co. B 12’yi gerektirmektedir. 24

Pirüvattan elde edilen başlıca fermentasyon ürünleri 25

Lipitlerin ve Proteinlerin Katabolizması Karbonhidrat dışındaki diğer karbon kaynaklarının, katabolizmaya girmeden önce işlem görmeleri gerekmektedir. Di- ve trigliserit gibi lipitler, lipatlar tarafından hidrolize edilerek serbest yağ asidi ve gliserol açığa çıkarırlar. Ardından yağ asitleri, B-oksidasyon metabolik yolu ile yıkımlanabilmektedirler. Hücre dışı proteinler proteazlar tarafından hidroli-ze edilerek, hücreye taşınabilecek serbest aminoasitleri açığa çıkarırlar. Aminoasit katabolizmasının başlangıcında, amino gruplarının uzaklaştırılması yer alır. Bu işlem genellikle, pirüvatın aminasyonu ile alaninin elde edilmesi gibi, aminogrupların keton konukçuya aktarıldığı transaminasyon ile gerçekleştirilir. 26

Enerji Depolama Tüm besinler fazlası ile mevcut olduğunda, mikroorganizmalar çoğunlukla besin yokluğunda kullanmak üzere depolayabilecekleri bileşikleri sentezler. Depo karbonhidratlarının hepsi hem karbon hem de enerji kaynağı olarak kullanılan glikojen ve nişasta gibi polisakkaritler ile trehaloz gibi disakkaritinden oluşmaktadır. Gerektiği takdirde bu polimerik kaynaklar, fosforilazlar tarafından glukoz 1 -fosfat halinde katabolizmaya direkt olarak girebilecek forma hidrolize edilirler. Polimetafosfatlardan oluşan volutin granülleri de bazı prokaryotlarda ve ökaryotlarda depolanmakta ve hem fosfat hem de enerji kaynağı olarak kullanılmaktadır. Kükürt bakterileri, H 2 S'i okside ederek kükürt granüllerini biriktirebilir. Ortamda sülfit kalmadığında, bu sülfür depoları sülfata okside olur. 27

Anabolizma: Biyomoleküllerin Sentezi ü Pek çok katabolik işlem, sadece ATP ve indirgenmiş koenzim formunda enerji üretmekle kalmaz, aynı zamanda biyosentez için anabolizmaya girebilecek karbon iskeletlerini de sağlamaktadır. ü Hem katabolik hem de anabolik rolü olan metabolik yollar, amfibolik olarak isimlendirilir. Amfıbolik metabolik yollar, EMP metablik yolunu ve TCA döngüsünü içermektedir. ü Amfibolik metabolik yolların pek çok reaksiyonları, bağımsız olarak geri dönüşümlüdür veya ikili fonksiyonu kolaylaştırmak için geri dönüşümsüz alternatif kısa (by-passes) yollara sahiptir. 28

Anaplöretik (yenileme, tekrar yerine koyma) Reaksiyonlar ü Biyosentez için, amfibolik (hem anabolik hem katabolik) metabolik yollardan ara ürünleri uzaklaştırmanın sonucu olarak, ortamda bu ürünlerin seviyeleri tükenebilir. ü Glikolizin tersi olan glukonogenez de benzer anaplöretik rolü yerine getirmektedir. Bu özellikle mikroorganizmanın, üç (C 3) ve iki karbonlu (C 2) bileşiklerden elde edilen pirüvat üzerinden gelişmesi sırasında önemlidir. Fakat daha önce de belirtildiği gibi reaksiyon aşamalarının tümü geri dönüşümlü değildir ve uygun alternatif kısa (by-passes) yollar gereklidir. 29

Nükleotidlerin ve Nükleik Asitlerin Sentezi ü Nükleotidler, halkasal yapıda bir azotlu bazdan, bir pentoz şekerden (riboz veya deoksiriboz) ve fosfattan oluşur. ü Çeşitli koenzimlerin önemli bileşenleri olup şekerlerin, aminoasitlerin ve hücre duvarı bileşenlerinin aktivasyonu ve transferinde anahtar rolleri vardır. ü Pirimidinler aspartik asit ve karbomoil fosfatın kondensasyon ürünü olan, orotik asitten meydana gelmektedir. ü Riboz 5 -fosfat, PP metabolik yolunda üretilir ve fosforibozil pirofosfatın (PRPP) aktifleşmiş formunda kullanılır. Riboz 5 -fosfat öncül maddesi, orotik asit ile pirimidin oluşturmak üzere kondensasyon tepkimesine girer. 30

NÜKLEİK ASİTLER • DNA ve RNA olmak üzere iki tip nükleik asit vardır. Bunların her ikisi de nükleotidlerinde bulunan şekerlerin deoksiriboz ya da riboz olarak değişmesi ile farklılık göstermektedir. • İki polimer de, komşu nükleotidlerin şeker ve fosfat gruplarının arasında kovalent bağların oluşması ile meydana gelir. Bu şeker fosfat omurgası tüm nükleik asit moleküllerinde ortaktır 31

Aminoasitlerin ve Proteinlerin Biyosentezi Genel olarak mikroorganizmalar protein üretimi için gereken 20 aminoasiti sentezleyebilme yeteneğine sahiptir. Aminoasitler için karbon iskeleti ara metabolizmalardan elde edilir, aminoasit grupları da direkt aminasyon veya pek çok aminoasit için genellikle transaminasyon ile yapıya eklenmektedir. 32

Polipeptitler, oldukça stabil kovalent peptit bağları ile bağlı aminoasit zincirinden oluşmaktadır. Bu bağlar, bir aminoasitin amino grubu ile diğer aminoasitin karboksil grubu arasında oluşmaktadır. Genellikle ʽʽprotein ˮ terimi bir veya birkaç polipeptitten oluşan son fonksiyonel topluluğun tümünü ifade eder. 33

■ Genetik kod, protein sentezi için başlangıç ve bitiş sinyalleri ile birlikte, proteinlerin aminoasitlerini temsil eden lineer üçlü baz serilerinden (kodonlar) oluşur. Bu kod, tüm organizmalar için hemen aynıdır ve pek çok aminoasit için dönüşüm geçirmiş durumdadır. Diğer bir deyişle, dört adet bazın 64 olası üçlü kombinasyonu ve 20 aminoasidi bulunmaktadır. Dolayısıyla, her bir aminoasit birden fazla üçlü kod ile temsil edilmektedir. 34

Bağlanma sırasını m. RNA üzerindeki kodonların t. RNA üzerindeki tamamlayıcı antikodonlara eşleşmesi belirler. Aminoasitler art arda bağlanarak polipeptit zincirini oluşturur, ardından polipeptit zinciri kendiliğinden ya da saperon proteinleri yardımı ile sekonder ve tersiyer yapıyı oluşturmak üzere katlanır. Yapıtaşı olan proteinler, yan zincirleri tarafından belirlenen çeşitli kimyasal özellikler gösterirler. Örneğin bazıları hidrofobik, bazıları ise hidrofilik niteliğe sahiptir. Bu nedenle, protein moleküllerinin farklı bölgelerinin özellikleri, içerdikleri aminoasitlerce belirlenir. 35

Monosakkaritlerin ve Polisakkaritlerin Biyosentezi ■ Karbonhidratlar, tekli üniteler (monosakkarit) halinde ya da iki üniteden (disakkarit) binlerce üniteye kadar (polisakkaritler) değişen aralıkta bir araya gelerek bulunabilirler. Aldehit grubu içeren monosakkaritler aldoz, keton grubu içeren monosakkaritler ise ketoz olarak adlandırılır. ■ Monosakkaritler ayrıca triozlar, tetrozlar, pentozlar, heksozlar vb. şekilde içerdekileri karbon sayısına göre de sınıflandırılmaktadır. Şeker neredeyse hiç bir zaman hücrede serbest halde bulunmaz. 36

Önemli mikrobiyal polisakkaritler aşagıdaki gibidir: 1) Glikojen ve nişasta, α-baglı glukoz ünitelerinden oluşan dallanmış zincirli homopolimerdir. Karbon ve enerji kaynağı olarak kullanılır. Örneğin glikojen ADP-glukoz pirofosforilaz ve glikojen sentaz (dallandıncı enzim) enzimlerinin aktiviteleri ile sentezlenmektedir. 2) Selüloz ve diğer hücre duvarı β-glukanları, β-bağlı glukoz ünitelerinden oluşur. 3) Kitin, N-asetilglukozamin polimeridir. 4) Peptidoglikan, peptitlerle çapraz asetilmuramik asit polimeridir. 5) bağlanmış N-asetilglukozamin ve N- Dekstran (çoğunlukla α-1, 6 bağla glukoz üniteleri) ve ksantan (esasen mannoz -glukuronik asit-mannoz trisakkarit ile alternatif glukoz ünitelerine bağlı selüloz omurgası) gibi çeşitli gamlar. 37

PEPTİDOGLİKAN BİYOSENTEZİ Peptidoglikan (PG), birbirini takip eden N-asetilglukozamin (NAG) ve N-asetil muramik asit (NAM) ünitelerinden oluşan sert lineer polisakkarit omurgası ile içerdiği aminoasit bileşenleri bakteriye bağlı olarak değişen tetrapeptit yan zincirlerinden oluşmaktadır. Her bir tetrapeptit, NAM molekülüne laktat ünitesi üzerinden bağlıdır. Yapı, yandaki tetrapeptit yan zincir kısımlarının ya doğrudan ya da kısa peptit köprüleri ile ağ benzeri yapı oluşturmak üzere çapraz bağlanması ile sertleştirilir. E. coli de bu durum, bir yan zincirin üzerindeki diaminopimelik asit (DAP) ile komşu peptit zincirindeki D-alanin arasında transpeptidasyon ile gerçekleşir. Genellikle, Gram-negatif organizmaların peptidoglikan yapsında Gram-pozitif hücre duvarına kıyasla daha az çapraz köprü bulunur. 38

Yağ asitleri ve Lipitlerin Biyosentezi ■ Lipitler, nispeten suda çözünmemesi ve polar olmayan çözücülerde çözünürlüğü temelinde sınıflandırılmıs. oldukça farklı bir bileşik ailesidir. Bunlar membranların önemli bileşenleridir ve poli B-hidroksibütirat ve trigliseritler gibi lipitler de bazı organizmalarda enerji kaynağı olarak kullanılabilmektedir. Basit lipitler, gliseridler, gliserol esterleri ve yağ asitleridir. ■ Doğal yağ asitlerinin çoğu çift sayıda karbon atomu içerir. Bunlar doymuş, doymamış veya çoklu doymamış olabilirler ve bu yağ asitleri sırası ile çift bağsız; bir çift bağlı; iki veya daha fazla çift bağ içerirler. ■ Doymuş yağ asitlerinin sentezinde koenzim A ve açil taşıyıcı proteinler (ACP) gereklidir. ■ Doymamış yağ asitlerinin sentezi için, biri moleküler oksijen gerektiren, iki farklı yol bilinmektedir. 39

Ototrofi Ototroflar karbon ihtiyaçlarını, Calvin döngüsü ile özümsenmiş (fikse edilmiş) CO 2’den sağlayabilirler. Enerji elde ediş şekillerine göre tanımlanmış iki temel ototrof tipi vardır. Fototroflar enerji kaynağı olarak ışığı; kemotroflar ise inorganik bileşikleri kullanırlar. Fototrofi Fototroflar, fotosentezin ışık tepkimeleri ile ışığı absorbe edebilme ve kimyasal enerjiye (ATP ve indirgenmiş koenzim) dönüştürebilme yeteneğine sahiptir. Üretilen kimyasal enerji, Calvin döngüsünde CO 2’yi bağlamak için kullanılır. Fotosentez, spesifik fotosentez pigmentleri tarafından ışık kuantumunun absorpsiyonu ile başlatılır. 40

Üç farklı tip fotosentez pigmenti vardır. 1) Bakteriyoklorofil, mor kükürt bakterilerinde, mor kükürt olmayan (kükürtsüz) bakterilerde ve yeşil bakterilerde, siyanobakteriler hariç tüm fotosentetik öbakterilerde bulunur. 2) Klorofiller siyanobakteriler, alg ve yüksek bitkilerin fotopigmentleridir. 3) Bakteriorodopsin, klorofil olmayan pigmenttir. Halobakteriler gibi arkealar (arkeler) tarafından kullanılır. Klorofiller, merkezinde magnezyum atomu içeren porfirinlerdir. Molekülleri membranlarla birleştirmeyi sağlayan hidrofobik yan zincirlere sahiptirler. Farklı klorofiller yan zincirleri bakımından birbirinden ayrılabilir. Bu zincirler aynı zamanda absorbsiyon spektrumunu da etkilemektedir. 41

ANOKSİJENİK FOTOSENTETİK BAKTERİLER Siyanobakteriler dışındaki bakterilerdeki fotosentetik ünite, bakteriyoklorofil ve yardımcı pigmentleri içeren ışık toplama kompleksi; bakteriyoklorofil ve bakteriyofeofitinlerden oluşan reaksiyon merkezi; ve ETS gibi üç bileşenden oluşmaktadır. İndirgenmiş kükürt bileşikleri, moleküler hidrojen veya organik bileşikler son elektron alıcısı olarak görev almaktadır. Dolayısıyla, fotosentez sırasında oksijen üretimi gerçekleşmemektedir. 42

OKSİJENSİZ FOTOSENTEZ ■ Siyanobakteriler, algler ve yüksek bitkilerde, fotosistem I ve II olmak üzere elektron taşıyıcı serileri ile bağlı iki fotosistem bulunmaktadır. Bu sistemler ATP ve NADPH moleküllerinin her ikisinin de elde edilmesinden sorumludur. Işığın uyarması ile fotosistem I reaksiyon merkezinden ayrılan elektronlar, ferrodoksine, ardından NADPH oluşturmak üzere NADP+ molekülüne aktarılır. Bu, fotosistem I'i pozitif yüklü olarak terk eder ve daha fazla elektron sağlayamaz. Fotosistem II ışık enerjisi ile yüklendiğinde, buradan fotosistem I'e elektron sağlanır. Elektronlar, fotosistem I'e elektron taşıma sistemi ile taşınır, böylece ATP üretilir. Burada elektronlar fotosistem II'ye asla dönmezler ve bu olay devirsiz fotofosforilasyondur. Dolayısıyla, fotosistem II reaksiyon merkezinin, işlemi devam ettirebilmesi için elektron sağlaması gerekir. Bu elektronlar suyun fotolizi ile sağlanmaktadır. Böylece oksijenik işlem için gereken oksijen açığa çıkar. 43

■ Kemolitotrofik Ototrofi ü Kemolitotroflar, enerji kaynağı olarak indirgenmiş inorganik bileşiklerden veya Calvin döngüsü ile fikse edilmiş karbon kaynağı olan CO 2 bileşiği gibi inorganik karbondan elde edilen elektronları kullanırlar. ü Bunlar proton-hareket ettirici gücü sağlayan elektron taşıma sistemlerine sahiptirler ve oksidatif fosforilasyon ile ATP üretirler. ü Bu yolla enerji elde edebilen bir cins, Thiobacillus'tur. Bunlar yaklaşık 2 µm uzunluğunda gram negatif çubuk bakterileri olup bazıları bulundukları ortamın p. H değerini önemli seviyede düşürebilen asdofillerdir. ü T. ferrooxidans, kömür madenleri ve madencilik atıkları gibi, asit kirliliği olan ortamlarda yaygındır. Buralarda, çoğunlukla demir ve kükürtün doğada en yaygın formlarından biri olan mineral pirit (Fe. S 2) bulunmaktadır. Asit madeni drenaj problemleri, piritin mikroorganizmalar tarafından oksidasyonunu takiben meydana gelmektedir. 44

Calvin Döngüsü ile Karbondioksit Fiksasyonu Karbondioksitin (CO ) özümsenmesi için ototroflar tarafından kullanılır. Bu 2 ototroflara algler, yüksek bitkiler, pek çok fotosentetik ve kemolitotrofik bakteri ve ototrofik metilotroflar örnek verilebilir. Bu metabolik yol, ökaryotik ototroflarda kloroplastın stromasında (matrikste) yer almaktadır. Bazı prokaryotlar Calvin döngüsünün önemli enzimlerini içeren özel karboksizomlara sahiptir. CO 2 gibi tek karbonlu bileşikten, çok karbonlu bileşiğin oluşması için önemli miktarda ATP ve NADPH gereklidir. Calvin döngüsü temel olarak; 1) Karboksilasyon 2) Redüksiyon 3) Rejenerasyon olmak üzere üç faza ayrılmaktadır. 45

Metilotrofik Metabolizma Metilotrofi, mikroorganizmaların CO 2 dışındaki bir karbonlu bileşikleri karbon kaynağı olarak kullanabilme yeteneğidir. Bu tek karbonlu bileşikler metan, metanol, format, karbon monoksit, klorometan ve siyanür gibi bileşikleri kapsamaktadır. Metilotroflar bakteriler, mayalar ve ipliksi mantarlar arasında bulunmaktadır. Bunlar aerobik veya anaerobik olabilirler ve üç kategoriye ayrılırlar. 1) Heterotrof metilotroflar, polikarbon bileşikleri üzerinde heterotrof olarak gelişebilirler. 2) Zorunlu metilotroflar, polikarbon substratlarında veya CO 2 üzerinde gelişemezler. 3) Ototrofık metilotroflar veya C 1 - kullanıcıları, indirgenmiş bir karbonlu (C 1) bileşikleri karbondioksite (CO 2) okside ederler. Ardından daha önce belirtildiği gibi Calvin döngüsü ile fiksasyonu gerçekleştirilir. 46

Metabolik Regülasyon ■ Mikroorganizmalar doğal olarak metabolizmaları üzerinde sıkı kontrol sistemlerine sahiptir. Fakat endüstriyel fermentasyonlarda kullanıldıklarında örneğin spesifik metabolitlerin yüksek üretimlerine çalışırken bu durumun değiştirilebilmesi gerekebilir. Bu yüzden, metabolik regülasyon çalışmaları endüstriyel mikrobiyolojide özel bir öneme sahiptir. ■ Metabolik yolların pek çoğu enerji ve hammaddeyi korumak üzere organize olmuş, çeşitli farklı sistemlerin kombinasyonu ile kontrol edilir. Aynı zamanda hücre bileşenleri de gereken optimum konsantrasyonlarda tutulmaktadır. 47

ENZİM VE SUBSTRATIN FİZİKSEL OLARAK AYRILMASI ■ Membrana bağlı çok sayıda organele sahip olan ökaryotik hücrelerde, hücrenin farklı bölümleri arasında metabolitlerin ve koenzimlerin taşınımını kontrol etmek için kompartmentalizasyon (kısımlara ayırma) kullanılabilir. Ayrıca kompartmentalizasyon benzer metabolik yolların aynı anda fakat ayrı işleyiş ve regülasyonuna olanak sağlar. Prokaryotlarda organeller bulunmaz ancak metabolitlerin ve koenzimlerin sitoplazma matriksinin farklı bölgeleri arasında konsantrasyon gradyenleri meydana getirmesi benzer regülatör rolü oynayabilir. 48

REGÜLATÖR (DÜZENLEYİCİ) ENZİMLER ■ Bir çok metabolik yol, reaksiyon boyunca karbon akışını ayarlamak için bir mekanizma sağlayan regülatör (düzenleyici) enzimlere sahiptir. Bu enzimlerden bazıları, genellikle bir kaç alt üniteden oluşan allosterik enzimlerdir ve Michaelis-Menten kinetiğine uymazlar. Aktiviteleri efektör ve modülatör olarak adlandırılan küçük moleküller tarafından değiştirilebilir. ■ Her metabolik yolun yavaş veya sınırlı hızdaki reaksiyonları katalizleyen, en az bir tane hız belirleyici (pacemaker) enzimi vardır. Bu, genellikle metabolik yolun ilk aşaması veya sahip olduğu tek aşamasıdır ve çoğu zaman geri dönüşümsüzdür. 49

Enzim sentezinin kontrolü ■ Bir enzimin konsantrasyonu, sentez hızı, dilüsyon oranı ve proteazlar tarafından inaktivasyon ve degredasyon hızı ile belirlenir. Bunun yanında enzim regülasyonunda en önemli rolü enzim sentezi oynar. Ancak metabolik yol akışını düzenleme konusunda, enzim aktivitesinin modifikasyonuna göre daha yavaştır. ■ Protein sentezinin translasyon aşaması prokaryotlarda önemli kontrol noktası olarak görülmemektedir. Ancak ökaryotik organizmalarda bu aşama daha önemli olabilir. Prokaryotlarda enzim sentezinin kontrolü genelde transkripsiyon seviyesinde (m. RNA sentezi) gerçekleşmektedir. E. coli'de B galaktozidazın indüksiyonu üzerine yapılan çalışmalar sonucunda gerçekleşen mekanizmalarla ilgili önemli bilgiler edinilmiştir. Bu enzim, laktozun glukoz ve galaktoza hidrolizini katalizlemektedir. 50

■ Fakat ortamda laktoz yoksa aktif olarak sentezlenmemektedir. Laktozun yokluğunda, regülatör genlerin kontrolü altında üretilen represör protein, Bgalaktosidaz yapısal geninin DNA'nın ön kısmında bulunan operatör bölgeye bağlanır. Bunun sonucunda RNA polimeraz tarafından m. RNA sentezi bloke edilir. Fakat ortamda indükleyici yani laktoz (özellikle allolaktoz) varsa represör moleküle bağlanarak şeklini değiştirir ve inaktif hale getirir. Konformasyon değişikliği bu moleküllerin DNA'nın operatör bölgesine bağlanmasını önler ve çalışacak genin transkripsiyonuna olanak sağlar. 51

Genel Regülasyon Mekanizması: SOLUNUM VE FERMENTASYON REGÜLASYONU • Oksijenli solunum ve fermentasyon, oksijen ve şekerlerin varlığına bağlı olarak ortam koşulları tarafından regüle edilmektedir. Pek çok mikroorganizma glikolizis yolu ile şeker katabolizmasını, aerobik koşullar altında, anaerobik koşullara göre daha yavaş hızda sergilemektedir. • Bunun sebebi, fermentasyona göre çok daha verimli olan aerobik solunumun ve ilgili oksidatif fosforilasyonun, aynı miktarda ATP elde etmek için daha az karbon ünitesini metabolize etmek zorunda olmasıdır. Glikolizisin oksijen tarafından baskılanması olayı Pasteur etkisi olarak tanımlanmıştır ve düşük şeker konsantrasyonlarında daha belirgindir. • Bazı mayalar Crabtree etkisi göstermektedir. Buna göre yüksek şeker konsantrasyonlarında, oksijen olsa bile fermentasyon solunumun önüne geçmektedir. Dolayısıyla EMP metabolik yolu ile üretilen NADH mitokondriyal solunum yerine daha çok fermentatif olarak okside edilmektedir. Bu durum, Crabtree-pozitif organizmaların sınırlı solunum kapasitesinin doyumu ile açıklanabilir. 52

KARBON KATABOLİT REPRESYONU Mikroorganizmaların çoğunda, glukoz katabolizması için gerekli enzimler yapısaldır, oysa diğer karbon ve enerji kaynakları için ek enzimlerin üretilmesi gerekir. Eğer besiyerinde diğer şekerlerle birlikte glukoz da varsa, ilk olarak glukoz kullanılır. Birincil metabolizmanın karbon katabolit regülasyonu, organizmalar için seçici bir avantaj sağlamaktadır. Metabolik sistemin bu şekilde ekonomik olarak kullanımı gerçekleşmektedir. Bu regülasyon aynı zamanda ikincil metabolizmanın da kontrolünde rol oynamaktadır. 53

ADENİLAT ENERJİ YÜKÜ Adenilatların (ATP, ADP ve AMP), hücrede hem tek başlarına hem de birlikte önemli kontrol fonksiyonları vardır. 54

İkincil Metabolizma ve Kontrolü İkincil metabolizma pek çok ipliksi mantarda gerçekleşmektedir ancak bakteriler arasında yaygınlığı oldukça azdır. İkincil metabolitleri üreten mikroorganizmalar kesikli kültür sırasında trofofaz ve idiofaz olmak üzere iki faz sergilemektedir. Trofofaz, kültürün gelişme fazı olup, idiofaz da bu fazı takiben ikincil metabolitlerin oluştuğu fazdır. 55

İkincil metabolizmanın kontrolü ilave olarak aşağıdaki şekillerde sağlanmaktadır: 1) Ribozomal olmayan peptit sentezi 2) Otoregülasyon 3) Son Ürün Regülasyonu 4) İndüklenebilir Etkiler 5) Azot ve Fosfat Regülasyonu 56

Ribozomal Olmayan Peptit Sentezi Genellikle protein sentezi DNA'nın genetik kodunun m. RNA'ya transkribe edilmesi ve ardından ribozomlar tarafından polipeptit oluşturmak üzere tranlasyonu ile gerçekleşir. Fakat antibiyotikler, bazı küçük peptitler, m. RNA ve ribozomlardan bağımsız alternatif bir mekanizma ile üretilirler. Bu peptitler, bazen antibiyotiklere özgü enzimler olarak da bahsedilen peptit sentetazlar tarafından sentezlenir ve eksponansiyel gelişimin sonunda üretilmektedir. Bu enzimler, m. RNA yerine peptit sentezi için kalıp olarak rol oynarlar. 57

Otoregülasyon Streptomyces türleri tarafından üretilen Faktör gibi küçük molekülleri içerir. Bunların, ikincil metabolitlerin oluşumunu arttıran, hormon benzeri otoregülatör bileşikler olarak işlev gördükleri gözlenmiştir. Faktör A, streptomisin biyosentezini, streptomisin direncini ve sporulasyonunu kontrol etmektedir 58

Son Ürün Regülasyonu Birincil metabolizmada olduğu gibi, son ürünler bazı ikincil metabolik yolların da geri beslemeli inhibisyonu için rol oynayabilmektedir. Örneğin, kloramfenikol antibiyotiği, kloramfenikol biyosentezinde görev alan aril amin sentetaz enzimini inhibe eder. 59

İndüklenebilir Etkiler Bazı antibiyotiklerin üretimleri fermentasyon ortamına eklenen indükleyici bileşikler ile artırılabilir. İndükleyicilerin çoğu birincil metabolitlerdir; örneğin, metionin aminoasidi, Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum'daki sefalosporin üretimini artırır. 60

Azot ve Fosfat Regülasyonu Amonyak gibi hazır metabolize edilebilir azot kaynaklarının, penisilin gibi ikincil metabolitlerin üretimini genellikle inhibe ettiği görülmektedir. Ayrıca kandisidin, streptomisin ve tetrasiklin oluşumu 10 mmol/L’nin üzerindeki fosfat konsantrasyonlarında inhibe olur. İnhibisyonun gerçekleşmemesi için genellikle maksimum fosfat seviyesi 1 mmol/L olmalıdır. 61

KAYNAKÇA Endüstriyel Mikrobiyolojiye Giriş, Michael J. Waites, Neil L. Morgan, John S. Rockey, Gary Higton Çeviri Editörü Doç. Dr. İrfan TURHAN, Palme Yayıncılık, 2015. 62