Rekombinant DNA Teknolojisi DO DR ASLIHAN KURT KIZILDOAN

Rekombinant DNA Teknolojisi DOÇ. DR. ASLIHAN KURT KIZILDOĞAN

Konu başlıkları • Bölüm 1: Gen klonlama ve DNA analizlerinin temel ilkeleri 8. 10. 2020 • Bölüm 2: Gen klonlamada vektörler: Plazmitler ve bakteriofajlar 15. 10. 2020 • Bölüm 3: Canlı hücrelerden DNA’nın saflaştırılması 22. 10. 2020 • Bölüm 4: DNA nın manipülasyonu 5. 11. 2020/ 12. 11. 2020 • Bölüm 5: Canlı hücrelere DNA nın girişi 19. 11. 2020 • Bölüm 6: E. coli klonlama vektörleri 26. 11. 2020 • Bölüm 7: ÖKARYOTLAR İÇİN KLONLAMA VEKTÖRLERİ 3. 12. 2020 • Bölüm 8: BELLİ BİR GENİ İÇEREN KLON NASIL ELDE EDİLİR? 10. 12. 2020 • Bölüm 9: Gen kütüphaneleri « 7. 12. 2020 • Bölüm 10: Çeşitli analiz yöntemleri 24. 12. 2020 • Bölüm 11: E. coli de rekombinant protein ifadesi 31. 12. 2020 • Bölüm 12: Mayalarda rekombinant protein ifadesi 7. 1. 2021 • Uygulama sınavı 14. 01. 2021 2

• Arasınav %70 • Uygulama%30 • Final %40 3

BÖLÜM 4: DNA nın manİpülasyonu Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. 6 edition. By T. A. Brown. Published 2010 by Blackwell Publishing. th

4. 3 Ligasyon: DNA moleküllerinin biraraya getirilmeleri • Rekombinant bir DNA molekülü oluşturmadaki son basamak vektörü ve klonlanacak geni birbirine yapıştırmaktır. • Ligasyon DNA ligaz enzimi tarafından katalizlenir. 5

4. 3. 1 DNA ligazın etki mekanizması • Genetik mühendisliğinde kullanılan ligaz enzimi T 4 fajı ile enfekte olan E. coli bakterisinden izole edilen T 4 DNA ligaz enzimidir. • Çift zincirli DNA ‘nın tek bir ipliğinde meydana gelen kırılmaları yanyana nükleotitler arasında fosfodiester bağlarını oluşturarak onarır • Ligaz enzimi ayrıca hücrede replikasyon ve rekombinasyon gibi doğal süreçlerde görev alan bir enzimdir. • Test tüpündeki reaksiyonda enzim iki molekülü birleştirirken her iki zincirde birer tane olmak üzere toplam iki fosfodiester bağı oluşturur. 6

4. 3. 2 Küt uç ligasyonu • İki küt uçlu parçanın bir araya getirildiği laboratuvar deneylerinde reaksiyon çok verimli gerçekleşmez. • Çünkü ligaz yapıştırılacak olan molekülü tutamamaktadır. Dolayısı ile uçları bir araya getirme olasılığı şansa dayanmaktadır. • Eğer mümkünse küt uç ligasyonu, doğru yönde moleküllerin bir araya gelme şanslarını arttırmak için, yüksek DNA konsantrasyonunda gerçekleştirilmelidir. 7

4. 3. 2 Yapışkan uçlar ligasyon etkinliğini arttırır • Aksine, komplementer yapışkan uçların ligasyonu çok daha etkindir. Nedeni; uyumlu yapışkan uçların H bağı ile birbiriyle bağ yapabilmesidir. Bu şekilde enzimin üzerinde çalışabilmesi için nispeten kararlı bir yapı oluşturur. • Eğer fosfodiester bağları oldukça hızlı bir şekilde sentezlenmezse, yapışkan uçlar tekrar ayrılır. • Bu geçici, baz eşleşmeli yapılar, uçların birbiri ile temasta olduğu zamanı uzatarak reaksiyon verimliliğini arttırır. 8

4. 3. 3 Yapışkan uçluları küt uçlu moleküle yerleştirme • Vektör molekülünün yapışkan uçlara sahip olduğu buna karşın klonlanacak DNA parçasının küt uçlu olduğu durumlarda ligasyonun gerçekleşmesi için üç farklı metot kullanılabilir: • Linker • Adaptör 9 • Homopolimer kuyruk

4. 3. 3 Yapışkan uçluları küt uçlu moleküle yerleştirme: Linker • Test tüpünde sentezlenen ve nükleotit dizisi bilinen kısa çift zincirli DNA’dır. 10

4. 3. 3 Yapışkan uçluları küt uçlu moleküle yerleştirme: Linker • Küt uçludur ancak içerisinde restriksiyon bölgesi taşır (Ör; Bam. HI) • DNA ligaz linker ları daha büyük küt uçlu DNA moleküllerine bağlar. • Bu reaksiyon küt uç ligasyonu olmasına rağmen, linker gibi sentetik oligonükleotitler çok fazla miktarda sentezlenebildiği ve ligasyon karışımına çok yüksek konsantrasyonda eklenebildiği için, çok verimlidir. • Reaksiyonda birden fazla linker DNA molekülünün ucuna bağlanacaktır. Ancak, Bam. HI ile kesim Bam. HI yapışkan ucunu tanıyan DNA parçasını verecektir. • Elde edilen yapışkan uçlu bu parça aynı enzimle 11 kesilmiş klonlama vektörüne ligasyona hazırdır.

4. 3. 3 Yapışkan uçluları küt uçlu moleküle yerleştirme: Linker • Linker kullanımının olumsuz yanı; – Bu nükleotit dizisini yapışkan hale getirmek amacıyla kullanılan restriksiyon enzimine ait tanıma bölgesinin küt uçlu DNA molekülünde de bulunması ve kesim sonucunda klonlanacak DNA’nı parçalara ayrılmasıdır. 12

4. 3. 3 Yapışkan uçluları küt uçlu moleküle yerleştirme: Adaptör • Kısa oligonükleotit dizileridir. • Ancak, linker dan farklı olarak bir yapışkan uç içerek şekilde sentezlenirler. • Mantık; adaptörün küt ucu ile DNA molekülünün küt ucunu yapıştırarak yapışkan uçlu bir molekül elde etmektir. • Bu metodun dezavantajı; • Adaptör moleküllerinin birbiri ile baz eşleşmesi yaparak dimerler oluşturmaları ve yeni DNA molekülünün bu nedenle yine küt uçlu olmasıdır. • Bu durum yine bir restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesimle yeniden yapışkan uç oluşturarak çözülebilir. • Ancak, bu durum linker yerine adaptör molekülünün tercih edilme nedenini ortadan kaldırır!!. 13

4. 3. 3 Yapışkan uçluları küt uçlu moleküle yerleştirme: Adaptör • Sorunun çözümü: • Adaptör molekülü sentezlenirken küt uç “doğal” DNA ile aynı (5’ PO 4 ve 3’ OH uçlu) sentezlenirken, yapışkan ucun 5’ P ucu fosfat grubundan yoksun sentezlenir. (5’ OH ve 3’ OH) • DNA ligaz 5′-OH ve 3′-OH uçları arasında fosfodiester köprüsü oluşturamadığından adaptör molekülleri dimer oluşturamazlar. • Adaptörler küt uçlu DNA molekülüne bağlanırlar. • Polinükleotit kinaz muamelesi ile anormal 5’ OH ucu 5’ P ye dönüştürülür. • Oluşan yapışkan uçlu DNA uygun vektöre ligasyon ile yerleştirirlir. 14

4. 3. 3 Yapışkan uçluları küt uçlu moleküle yerleştirme: homopolimer kuyruk • Homopolimer tüm alt birimleri aynı olan bir polimerdir. • Ör, sadece deoksiguanozinden yapılmış bir DNA zinciri bir homopolimerdir ve polydeoksiguanozin veya poly(d. G ) olarak ifade edilir. • Kuyruk; terminal deoskinükleotidil transferaz enzimi ile bir seri nükleotidi DNA molekülünün 3’ OH ucuna ekleyerek meydana getirilir. • Bu reaksiyon sadece bir deoksinükleotit ile gerçekleştirilirse bir homopolimer kuyruk oluşturulur. • iki kuyruk içeren molekülün birbirine yapışabilmesi için homopolimerlerin komplementer olmaları gerekir. 15 • Sıklıkla, polideoksisitozin, poly (d. C), vektöre, poly (d. G) ise klonlanacak DNA ya bağlanır. • İki molekül bir araya getirildiğinde baz eşleşmesi gerçekleşir.

4. 3. 3 Yapışkan uçluları küt uçlu moleküle yerleştirme: homopolimer kuyruk 16

4. 3. 3 Yapışkan uçluları küt uçlu moleküle yerleştirme: homopolimer kuyruk • poly(d. G) ve poly(d. C) kuyrukları genelde eşit uzunlukta olmayacaklarından baz eşleşmesi yapan rekombinant moleküller arasında kesinti yada boşluklar görülecektir. • Onarım için; önce Klenow polimeraz ile boşluklar doldurulur, ardından DNA ligaz gelerek final fosfodiester bağlarını sentezler. • Bu onarım reaksiyonu her zaman test tüpünde gerçekleştiirlmek zoe -runda değildir. • Eğer komplementer homopolimer kyrukları 20 nükleotitden daha uzunsa çok daha karralı baz çifti etkilrşimi meydana gelir. • Rekombinant DNA molekülü tam olarak yapışmasa bile baz eşleşmesi ile birarada kalabilir, bu çoğu kez konak hücreye aktarım için yeterli karralıklıta olur. • Hücrenin kendi DNA polimeraz ve DNA ligazı rekombinant DNA 17 molekülünü onararak test tüpünde başlamış olan yapımı tamamlarlar.

4. 3. 4 DNA topozomeraz ile küt uç ligasyonu • Hücrede DNA topoizomerazlar çift zincirli DNA molekülüne ekstra dönüş ya da gevşeme kazandıran enzimlerdir. • DNA replikasyonu sırasında sarmalın gevşemesi (açılması) için dönüşler kaldırılırken yeni sentezlenen DNA molekülüne süperkatlanmalar vermek için dönüşler eklenir. • DNA topoizomerazlar çift sarmalı döndürmeden, DNA iskeletinde geçici tek ya da çift zincir kırıkları oluşturarak, DNA molekülünün iki zincirini ayırabilirler. • Bu nedenle DNA topoizomerazlar hem nükleaz hem de polimeraz aktivitesine sahiptirler. 18

4. 3. 4 DNA topozomeraz ile küt uç ligasyonu • Küt uç ligasyonu bir topoizomeraz ile gerçekleştirilmek istenirse özel bir vektör tipine ihtiyaç söz konusudur. • Bu; vaccinia virüsünün DNA topoizomerazının nükleaz aktivitesi ile doğrusal hale getirilen bir plazmiddir. • Vaccinia topoizomeraz; vektör DNA sını sadece bir tek yerinde bulunan CCCTT nükleotidinden keser. • Kesim sonrasında, topoizomeraz enzimi oluşan küt uçlara kovalent bağı ile bağlı kalır. • Bu vektöre klonlanacak olan DNA alkalen fosfataz enzimi ile muamele edilerek 5’ P ucundan P uzaklaştırılarak 5’ OH ucu oluşturulur. 19

4. 3. 4 DNA topozomeraz ile küt uç ligasyonu • Fosfataz ile muamele edilmiş moleküllerin vektöre eklenmesi ona bağlı topoizomerazın yeniden aktifleşmesine ve ligasyon fazına geçilmesine neden olur. • Vektörün 3′-P ucu ile DNA molekülünün 5′-OH ucu arasında ligasyon gerçekleşir. • Küt uçlu moleküller bu şekilde vektöre sokulmuş olur. Her birleşme noktasında sadece bir zincir yapışır, bu sorun, rekombinant moleküllerin hücreye aktarılması sonrasında hücre enzimleri tarafından onarılarak ortadan kaldırılır. 20