GENETIK KOPYALAMA KLONLAMA Genetik kopyalama dier bir ifadeyle

GENETIK KOPYALAMA (KLONLAMA)

• Genetik kopyalama diğer bir ifadeyle klonlama , DNA molekülü hücre veya organizmanın genetik olarak birçok benzerinin üretilmesi işlemidir. • Biyolojide klonlama , bazı organizmaların veya hücre tiplerinin eşeysiz üreme yoluyla çoğalması olarak tanımlanmaktadır.

• Günümüzde yanık tedavisinde kullanılan inan deri hücreleri , labaratuvar ortamında klonlama teknikleri kullanılarak yapılan hücre üretimine güzel bir örnektir. • Klonlama bilimsel araştırmalarda, tıp, farmokoloji, veterinerlik, ve ziraat gibi alanlarda bir çok amaç için kullanılmaktadır.

KLONLAMANIN TARIHSEL GELIŞIMI • 1980’ lerde embriyo klonlama yöntemiyle , embriyo hücrelerinden ilk memeli canlılar; inek, koyun, fare, domuz ve keçi klonlanmıştır. • 1996 yılında 9 günlük embriyolardan alına hücre çekirdekleri kullanılarak iki koyun kopyalanır. • 1995’te insan Alzhemier genini taşıyan transgenik fareler klonlanmıştır. • 1997 yılında İan Wilmut ve arkadaşları ilk defa ‘Dolly’ adında bir koyunu yaklaşık bir yıl önce somatik hücre çekirdek transferi yöntemi ile klonladıklarını açıklar. • 1998 yılında ABD ‘de ACT şirketindeki araştırıcılar, sütlerinde insanların kullanımı için ilaçların üretildiği transgenik buzağıları klonlarlar. • 1999’dan sonra somatik hücre çekirdek transferi yöntemiyle farklı türdeki hayvanlar klonlamaya başlamışlardır.

GENETIK KLONLAMANIN BÖLÜMLERI • Üç bölümde incelenir. A. MOLEKÜLER KLONLAMA B. ÜREME AMAÇLI KLOANLAMA C. TERAPÖTİK KLONLAMA

MOLEKÜLER KLONLAMA • Moleküler klonlama, herhangi bir organizmaya ait DNA , DNA parçaları ya da genlerin uygun bir vektör yardımıyla konakçı hücrelerde çoğaltılmasıdır. • DNA’ yı klonalamak için yapılması gereken işlemler şu şekilde sıralanabilir. 1) DNA İzolasyonu : DNA’nın çeşitli yöntemler kullanılarak elde edilmesidir. DNA bitkisel ve hayvanlar dokular gibi doğal kaynaklardan saf olarak elde edilebilir. DNA’ nın elde edileceği kaynağa göre ya da bitkisel, hayvansal veya bakteriyal kaynaklı olmasına göre izolasyon yöntemlerinde farklılıklar olabilmektedir. Fakat bu farklılıklara rağmen temelde yapılan işlemler aynıdır. Öncelikle çekirdek enzimatik olarak hücresel debristen ayrıştırılır. Daha sonra fenol ve kloroform gibi kimyasallar kullanılarak proteinler ortamından uzaklaştırılır. En sonunda alkol ve tuz ortamında DNA çöktürülür.

2) UYGUN KLONLAMA VEKTÖRÜNÜN (TAŞIYICI) SEÇİLMESİ : • Klonlama vektörlerinin plazmitler, viral vektörler , kozmid vektörler, Bozmid Yapay Kromozomu ve Maya Yapay Kromozomu olmak üzere bir çok tipi vardır.

3) VEKTÖRÜN VE İZOLE EDİLEN DNA’nın AYNI RESTRİKSİYON ENDONÜKLEAZ ENZİMLERİ İLE KESİLMESİ • Restriiksiyon endonükleaz enzimleri bakterilerde bulunan ve yabancı organizmadan gelen DNA’yı parçalayan enzimlerdir. • Bu enzimler bakterileri yabancı DNA’ların istilasından korumak için evrimleşmişlerdir.

4) LİGASYON : DNA’nın vektöre (taşıyıcı) ligaz enzimi ile bağlanması aşamasıdır. Ligasyon işleminde, aynı restriksiyon enzimi ile kesilmiş ve yapışkan uç oluşturulmuş DNA ve vektör, DNA ligaz enzimi kullanılarak birleştirilmektedir.

5) REKOMBİNANT DNA’nın KONAK ORGANİZMAYA (Bakteri veya maya) TRANSFER EDİLMESİ : Ligasyon işleminden sonra rkombinant DNA’ ların bakteri veya maya gibi konakçı hücrelere aktarılmasında transformasyon , transfeksiyon ve elektroporasyon gibi teknikler kullanılmaktadır. Plazmitlerde tronsformasyon , bakteriyofajlarda transfeksiyon BAC’larda ise elektroporasyon ile rekombinant DNA’ lar aktarılmaktadır.

6)SELEKSİYON : Rekombinat DNA ürünlerini taşıyan bakteri kolonilerinin seçilmesi aşamasıdır. Rekombinant klonlar ile rekombbinant olmayan klonları birbirindrn ayırmak için seleksiyon işleminin yapılması gerekmektedir. Seleksiyon işlemşnde antibiyotik direnç genleri gibi belirteç genlerden yararlanılır.

B) ÜREME AMAÇLI KLONLAMA • Üreme amaçlı klonlama ile ilgili bugüne kadar birçok çalışma yapılmıştır. Üreme amaçlı klonlamada , embriyo klonlama ve çekirdek transferi ile klonlama şeklinde iki farklı teknik kullanılmaktadır. 1) EMBRİYO KLONLAMA : Döllenmiş embriyodan bir veya daha fazla hücre alınarak genetik olarak benzer hücreler üretme tekniğidir. • Esasen ilk embriyo klonlama çalışmasının 1891 yılında Dreisch , denizkestanasi embriyolarındaki 2 ve 4 hücreli evredeki blastomerleri ayırarak yapmıştır. • Embriyo klonlama yöntemiyle 1981 yılında ilk defa inek, koyun , keçi ve domuz gibi çiftlik hayvanları klonlanmaya başlamıştır. Bu tip klonlanan canlılar, bir embri, yonun hücrelerinden oluştukları için genomik yapıları da birbirinşn aynısıdır.

2)ÇEKİRDEK TARNSFERİ : Bu klonlama ise yaşayan bir canlının aynı genomik yapısına sahip organizma üretme tekniğidir. İlk çekirdek transferi uygulaması semenderlerde 1914 yılında Hans Spemann , kurbağalarda ise 1954’de Robert Briggs ve Thomas J. King tarafından yapılır. Her iki çalışmada da erken dönemdeki embriyonik hücre çekirdeği kullanılarak klonlama yapılır ve başarılı sonuçlar elde edilir. • Memeli canlıların klonlanması ile ilgili ilk çalışmayı ise 1984 yılında Danimarkalı araştırıcı Steen Willadsen yapar. • Embriyonik hücre çekirdeği yerine somatik hücre çekirdeği kullanılarak ilk defa bir koyun, 1997 yılında Ian Wilmut tarafından kullanılmış.

• Wilmut , erişkin koyun meme hücresi çekirdeği kullanarak koyun ‘ Dolly’ yi klonlar. Dolly , 1996 yılında İskoçyanın Roslin Enstitüsü’nde , 277. denemeden sonra sağlıklı olarak dünyaya gelir. Dolly , daha sonraki gelişim dönemlerinde sağlık sorunları ile yüze kalır ve ancak 6 yıl yaşama imkanı bulur. • Somatik çekirdek transferi ile klonlamanın aşamaları şu şekilde sıralanır.

SOMATIK HÜCRENIN (VERICI HÜCRE) HAZIRLANMASI • Çekirdek transferinde kullanılacak somatik hücrelerin labaratuar koşullarında ve kültür ortamında G 1 ve G 0 fazına getirilmeleri gerekmektedir. Bunun için uygulanan birkaç yol vardır. Bunlardan bir tanesi kültür ortamındaki besin içeriği kaldırılarak hücrelerin büyümesini engellemek ve hücreleri G 0 (dinlenme evresi ) noktasında durdurmaktadır. Bu uygulamanın amacı özelleşmiş olan beden hücresinin gelişim saatine embriyo oluşum aşamasını getirmek, başka bir ifadeyle hücreyi totipotent yapmaktır.

YUMURTA HÜCRESININ (ALICI HÜCRE) HAZIRLANMASI • Çekirdek transferi yöntemi ile klonlamada kullanılacak alıcı hücrelerde bazı özelliklerin olması gerekmektedir. Bu alıcı hücreler olgunlaşmış yumurta hücreleri olmalıdır. Olgunlaşan hücrelerin pipetlerle çıkarılarak füzyona hazır hale getirilmektedir.

FÜZYON AŞAMASI • Bu aşamada, kültürde G 1/G 0 fazına getirilen verici hücreler çekirdeği çıkarılmış Metafaz II fazındaki yumurta hücresinin zonası altında bırakılır. Füzyon ile verici hücrenin çekirdeğinin alıcı yumurta hücresinin stoplazmasına girmesi sağlanır. Füzyon işleminin başarılı olması için elektrik akımı veya kimyasallar kullanılmaktadır.

AKTIVASYON AŞAMASI • Ortama ilave edilen bir takım aktivatörler ile hücre bölünmesi uyarılır.

EMBRIYOLARIN DIŞI ORGANIZMAYA AKTARIMI • Oluşan embriyolar kültür ortamında geliştirildikten sonra taşıyıcı dişi organizmanın rahmine aktarılarak gelişmeleri sağlanmaktadır. Doğacak olan yavrular verici hücrenin genetik yapısını taşıyan klonlar olacaktır.

C) TERAPÖTIK AMAÇLI KLONLAMA • Çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılmak üzere ihtiyaç duyulan birçok protein, enzim, hormon ve antibiyotiklerin üretiminde, yani terapötik kullanımlar için, klonlama tekniğinden yararlanılmaktadır. • İster terapötik amaçlı, ister üreme amaçlı olsun klonlamadaki başarı oranı klonlanan türlere ve verici tiplerine göre değişmektedir. Şimdiye kadar yapılan klonlamalarda, başarılı doğumlar ile dünyaya gelmiş olsalar bile, klonlanan hayvanlarda daha sonraki dönemlerde bir takım sağlık sorunları görülmüştür.

GENETIK KLONLAMANIN UYGULAMA ALANLARI • TIP ALANINDAKİ UYGULAMALAR • Tıp alanında, klonlamanın temel amacı genetik hastalıkları tedavi etmektir. Birçok genetik hastalıkta bir hormon, enzim veya proteinin vücuttaki üretiminde eksiklikler olabilir. Günümüzde, eksik olan bir hormon veya metabolit, klonlama yöntemleri ile üretilerek hastalara verilebilmektedir. Terapötik amaçlı olarak ökaryotik geni klonlamada hem rekombinant DNA teknolojisinden hem de transgenik hayvan klonlama tekniklerinden yararlanılabilmektedir.

GEN ÜRÜNÜ KLİNİK KULLANIM TRANSGENİK HAYVAN Faktör IX Hemofili B tedavisinde kullanılan kan pıhtılaşma proteini Koyun Alfa – 1 antitripsin Emfizema ve sistik fibrosis tedavisinde kullanılan proteaz inhibitörü Koyun Antitrombin III ATIII eksikliği tedavisinde ve açık kalp ameliyatlarında kullanılan koagülasyon inhibitörü Keçi Doku plazminojen aktivatörü Ani kalp krizlerinin tedavisinde Keçi özellikle kan pıhtılarını çözmek için kullanılır. Laktoferrin Demir bağlayan protein olarak İnek kullanılan ek besin maddesidir. Protein C Hemofili tedavisinde ve ameliyatlarda kullanılan antikoagülen bir proteindir. Trangenik Klonlardan Elde Edilen Terapötik Amaçlı Proteinler Domuz

TARIM ALANINDAKI UYGULAMALAR • İstenilen karakterde yeni bitkilerin geliştirilmesinde genetik biliminin büyük rolü vardır. Geçmişte çoğu zaman tarımla uğraşanlar bunun için aynı türün farklı varyeteleri arasından çaprazlamalar yapmak zorunda kalmışlardır. Tarım alanında gen mühendisliği tekniklerinden yararlanmak büyük bir gelişim olarak değerlendirilmektedir. Nitrojen fiksasyonu yapabilen, herbisit ve pestisitlere karşı direnç gösteren , patojenlere karşı daha güçlü savunma yapan , don olayına dayanıklı , ürünün raf ömrünü uzatan , lezzet arttıran ve daha besleyici özelliği olan bitkiler üretmek mümkün hale gelmiştir. Herbisit dirençlilik genlerinin mısır, pamuk, tütün gibi ekonomik olarak önemli olan bitkilerin içine sokulması çiftçilerin kullanacakları herbisit miktarının ayarlayabilmelerini kolaylaştırmıştır.

HAYVANCILIK ALANINDAKI UYGULAMALAR • Özellikle et kalitesi, süt verimi, döl verimi ve hastalıklara karşı dirençlilik gibi özellikler göz önünde bulundurularak çiftlik hayvanları klonlanabikmektedir. Kaliteyi yükseltecek bazı genlerin eklendiği veya çıkarıldığı transgenik hayvanların klonlanması bugün artık mümkündür. Örneğin; yakın zamanda Pr. P (Prion) proteinin sentezleyen genin delesyonunu taşıyan sığırlar klonlanmıştır. Bu protein , sığırlardan deli dana hastalığına neden olmaktadır ve bu genin delesyonunun olduğu sığırların klonlanması durumunda hayvanlar bu hastalığa direnç kazanmış olmaktadır.

• Sadece çiftlik hayvanlarında değil , yabani hayvanlarda da klonlama çalışmaları yapılmaktadır. Özellikle nesli tükenmekte olan hayvanların sayılarının arttırılmasında klonlama teknolojisi büyük önem arz etmektedir. • Nesli tükenmekte olan hayvanların klonlanmasında yakın akrabalarının yumurta hücrelerinin kullanılmasına özen gösterilmektedir. Örneğin ; 2001 yılında bir yaban koyunu evcil bir koyunun yumurta hücresinde klonlanabilmiştir.

SORULAR • Genetik klonlama ……………… , …………………. , ……………… olmak üzere üç kısımda incelenir. (moleküler klonlama , üreme amaçlı klonlama ve terapötik klonlama ) • Hücre veya organizmanın genetik olarak birçok benzerinin üretilmesi işlemine ………… denir. (Klonlama) • İlk klonlanan hayvan …… dur. Adı ……. Dir. (koyun , Dolly) • Embriyo klonlama ; döllenmiş embriyodan bir veya daha fazla hücre alınarak genetik olarak benzer canlılar üretme tekniğidir. (D) • Çekirdek transferi ile ortama ilave edilen bir takım aktivatörler ile hücre bölünmesi uyarılır. (Y)

• KLONLAMA NEDİR ? • Biyolojide klonlama , bazı organizmaların veya hücre tiplerinin eşeysiz üreme yoluyla çoğalması olarak tanımlanmaktadır • MOLEKÜLER KLONLAMAYI AÇIKLAYINIZ ? • Moleküler klonlama, herhangi bir organizmaya ait DNA , DNA parçaları ya da genlerin uygun bir vektör yardımıyla konakçı hücrelerde çoğaltılmasıdır

GÜL KARATEKE 141104737