Rekombinant DNA Teknolojisi DO DR ASLIHAN KURT KIZILDOAN

Rekombinant DNA Teknolojisi DOÇ. DR. ASLIHAN KURT KIZILDOĞAN

Konu başlıkları • Bölüm 1: Gen klonlama ve DNA analizlerinin temel ilkeleri 8. 10. 2020 • Bölüm 2: Gen klonlamada vektörler: Plazmitler ve bakteriofajlar 15. 10. 2020 • Bölüm 3: Canlı hücrelerden DNA’nın saflaştırılması 22. 10. 2020 • Bölüm 4: DNA nın manipülasyonu 5. 11. 2020/ 12. 11. 2020 • Bölüm 5: Canlı hücrelere DNA nın girişi 19. 11. 2020 • Bölüm 6: E. coli klonlama vektörleri 26. 11. 2020 • Bölüm 7: ÖKARYOTLAR İÇİN KLONLAMA VEKTÖRLERİ 3. 12. 2020 • Bölüm 8: BELLİ BİR GENİ İÇEREN KLON NASIL ELDE EDİLİR? 10. 12. 2020 • Bölüm 9: Gen kütüphaneleri « 7. 12. 2020 • Bölüm 10: Çeşitli analiz yöntemleri 24. 12. 2020 • Bölüm 11: E. coli de rekombinant protein ifadesi 31. 12. 2020 • Bölüm 12: Mayalarda rekombinant protein ifadesi 7. 1. 2021 • Uygulama sınavı 14. 01. 2021 2

• Arasınav %70 • Uygulama%30 • Final %40 3

BÖLÜM 6: E. coli klonlama vektörleri Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. 6 edition. By T. A. Brown. Published 2010 by Blackwell Publishing. th

• • • E. coli plazmidlerine dayalı klonlama vektörleri En basit klonlama vektörleri, ve gen klonlamada en yaygın kullanılanlar küçük bakteri plazmidlerine dayalı olanlardır. E. coli ile kullanılabilen çok sayıda farklı plazmid vektörleri bulunmaktadır ve birçoğu ticari olarak satılmaktadır. Yüksek transformasyon verimliliği, transformantlar ve rekombinantlar içinuygun seçici markörler, ve nispeten büyük (10 kb’a kadar) DNA ların klonlanma yeteneği gibi istenen özellikler ile saflaştırma kolaylığını birleştirirler. Çoğu “rutin” gen klonlama deneyleri bu tip plazmid vektörlerin bir veya birkaçını kullanır. Geliştirilen ilk vektörlerden biri p. BR 322 dir. p. BR 322 en yeni klonlama vektörlerinin sofistike özelliklerini içermez ve araştırmalarda artık yaygın kullanılmamaktadır. Fakat herhangi bir plazmid klonlama vektörünün önemli v 1 e 56 temel özelliklerine sahiptir.

p. BR 322 • “p” : plazmid • “BR” vektörün orjinal olarak oluşturulduğu laboratuvarı tanımlar (plazmidi geliştiren iki bilim insanının baş harfleri) 15 7

p. BR 322 • p. BR 322 4363 bç uzunluğundadır. • Çok büyük olmadığından kolaylıkla saflaştırılabilir, ayrıca 6 kbç’ya kadar DNA fragmenti içine klonlanabilir, • İki antibiyotik direnç geni içerir (ampisilin ve tetrasiklin) • DNA parçasının Pst. I, Pvu. I, veya Sca. I kesim bölgesine sokulması amp. R genini inaktive eder. Ve, Bam. HI ve Hind. III ile kesim tetrasiklin direncini inaktive eder. • Kopya sayısı yüksektir. Transforme E. coli de 15 molekül bulunmaktadır. • Kloroform gibi bir protein sentezi inhibitörü varlığında kopya sayısı 1000 -3000’e çıkabilir. 7

p. BR 322 nin oluşturulması 8

p. BR 327 • p. BR 322 den 1089 bç lik segment uzaklaştırılarak p. BR 327 oluşturulmuştur, bu delesyon amp. R ve tet. R genlerini tüm olarak kapsar ancak konjugatif özelliklerini kaybeder • p. BR 327 p. BR 322’den daha yüksek kopya sayısına sahiptir; 30 -45 adet/hücre • Non konjugatif bir plazmiddir. Kendi 160 transferini doğrudan yönlendiremez.

p. UC 8 -lac seleksiyon plazmidi • p. BR 322 den türevlenir, ancak ampisilin geni ve replikasyon orjinini içerir. • amp. R geninin nükleotid sekansı değiştirilmiş ve bu sayede özgün restriksiyon bölgeleri içermemesi sağlanmıştır. • Tek kesim bölgeli restriksiyon endonükleaz tanıma bölgeleri lac. Z’ gen segmentine kümelenmiştir. 16 1

• Üç önemli avantajı – p. UC 8’in yapımına katılan manipülasyonlar replikasyon orjininde bir şans mutasyonunun oluşması ile hücredeki kopya sayısının 500 -700 e çıkması – Rekombinant hücrelerin tespitinin tek bir basamakta gerçekleştirilmesi (p. BR 322 ve p. BR 327 de iki basamaklı prosestir) ampisilin ve X gal içeren plaklara transformasyon sonrası kültürün ekilmesi, – p. BR 322 ve p. BR 327 den farklı olarak restriksiyon kesim bölgelerinin kümelenmiş olması (MCS)162

p. GEM 3 Z-klonlanan DNA’nın in vitro transkripsiyonu • p. GEM 3 Z; p. UC vektörüne çok benzerdir. amp. R ve lac. Z′ içerir. • lac. Z’ de MCS bulunur (restriksiyon enzimi kesim bölgeleri) büyüklüktedir. • p. UC den farkı; iki promotor bölgesine sahip olmasıdır. Promotor dizileri restriksiyon bölge kümelerinin her iki yanında yer alırlar. • Bu şu anlama gelir; Eğer rekombinant p. GEM 3 Z purifiye RNA polimeraz ile bir test tüpünün içerisinde karıştırılırsa, transkripsiyon gerçekleşir ve klonlanan DNA parçasının RNA transkriptleri meydana gelir. Sentezlenen RNA hibridizasyon probu olarak veya RNA prosesi veya 16 3 protein sentezi çalışmalarında kullanılabilir.

p. GEM 3 Z • p. GEM 3 Z promotorları E. coli RNA polimeraz tarafından tanınan standart sekanslar değildir: Bunlardan biri T 7 bakteriyofajı tarafından kodlanan RNA polimeraza özgü iken diğeri ise SP 6 fajı nın RNA polimerazıdır. • Bu RNA polimerazlar E. coli ile fajın enfeksiyonu sırasında sentezlenirler ve faj genlerinin transkripsiyonundan sorumludurlar. • Çok aktif enzimler olduklarından in vitro transkripsiyon için seçilirler (Litik enfeksiyon siklusu sadece 20 dk. sürer!). • Bu polimerazlar dakikada 1 -2 mg RNA sentezleyebilir (Standart E. coli RNA polimerazlarından daha fazla). 164

Bakteriyofaj temelli vektörler • İnsersiyon/replacement vektörler • genomu 49 kb büyüklüğündedir ve en fazla 3 kb yeni DNA içerisine sokulabilir.

Bakteriyofaj temelli vektörler • Ayrıca, aynı enzime ait restriksiyon kesim bölgeleri birden fazladır. Bu da klonlama çalışmalarında bir problemdir. •

Bakteriyofaj temelli vektörler • Daha büyük DNA parçalarının klonlanması için hayati önemi olmayan (esansiyel olmayan) faj DNAsının çıkarılması çözüm yoludur (faj DNA sı 15 kilobaza kadar küçülebilir). Dolayısıyla 25 (18? ) kb a kadar yeni DNA klonlanabilir. • Ayrıca, in vitro mutagenez ile bir enzime ait ikinci ve daha fazla tanıma dizisi değiştirilerek yeni klonlanacak gen için faj DNA sında yerleşme noktası oluşturulabilir.

Büyük DNA parçaları kozmid yardımı ile klonlanabilir En ileri temelli vektör kozmiddir. • • Kozmidler bir faj DNA molekülü ile bir bakteri plazmidi nden oluşan hibritlerdir. • Tasarımları lambda DNA molekülünü faj protein kılıfına paketleyen enzimlerin işlevsel olması için sadece cos bölgelerine gereksinim duymalarına odaklıdır. • In vitro paketleme reaksiyonu sadece lambda genomları ile değil 37 -52 kblık DNA ile ayrılan cos bölgeleri taşıyan herhangi bir molekülle de çalışır. 166

Büyük DNA parçaları kozmid yardımı ile klonlanabilir • Bir kozmid temelde cos bölgesi içeren bir plazmiddir. • Ayrıca, seçici markör geni, plazmid replikasyon orjinini de içermektedir. Kozmidler tüm lambda genlerini içermedikleriden plak oluşturmazlar. Yerine, tıpkı bir plazmid gibi seçici besiyerinde koloniler oluşurlar • 40 kb a kadar gen klonlanabilir 166

Kozmid ile klonlama Kozmid tek bir restriksiyon enzim kesim bölgesinden kesilir ve yeni DNA parçası içine yerleştirilir. Tam bir kesim kozmidde klonlanamayacak derecede küçük boyutlarda DNA fragmentleri oluşturacağından kısmi kesim gerçekleştirilir. Ligasyon gerçekleştirilir, katenanlar oluşturulur. Eklenen DNA doğru büyüklükte olduğunda, in vitro paketleme ile cos yerleri kesilir ve rekombinant kozmidler olgun faj partiküllerine yerleştirilir. Bu fajlar E. coli enfeksiyonunda kullanılır. Plak yerine seçici besiyerinde üreyen koloniler oluşur. Elde edilen koloniler rekombinanttır. Çünkü rekombinant olmayan doğrusal kozmidler başlıklara paketlenemeyecek kadar küçüktürler. 19

ya da diğer yüksek kapasiteli klonlama vektörleri ile genomik kütüphanelerin oluşturulması • Tüm bazlı vektörlerin ana kullanım amacı, plazmid (<10 kb) veya M 13 (< 3 kb) vektörleri tarafından işlenemeyecek kadar uzun DNA fragmanlarını klonlamaktır. • EMBL 4 gibi bir ikame (replacement) vektörü, 20 kb'ye kadar yeni DNA taşıyabilirken bazı kozmidler, 40 kb'ye kadar DNA fragmanlarını taşıma kapasitesine sahiptir. 20

ya da diğer yüksek kapasiteli klonlama vektörleri ile genomik kütüphanelerin oluşturulması • Bu kadar uzun DNA parçalarını klonlama yeteneği, genomik kitaplıkların hazırlanabilmesine imkan tanır. • Bir genomik kütüphane, tek bir organizmada bulunan tüm DNA'yı içeren bir dizi rekombinant klondur. • E. coli genom kütüphanesi tüm genlerini içerir ve istenen gen kütüphaneden çekilerek çalışılabilir. • Genomik kütüphaneler yıllarca bozulmadan kalabilirler. • Kopyaları bir araştırma grubundan diğerine gönderilebilmesi için çoğaltılabilir. 21

ya da diğer yüksek kapasiteli klonlama vektörleri ile genomik kütüphanelerin oluşturulması • Bir genom kütüphanesi elde etmek için kaç klon gereklidir? Formül: • N : gereken klon sayısı • p: herhangi bir genin olma olasılığı • a: vektöre yerleştirilen DNA fragmentlerinin ortalama büyüklüğü • b: toplam genom büyüklüğü 22

Tablo 6. 1, bir replacement (ikame) vektörü veya bir kozmid kullanılarak oluşturulmuş çeşitli organizmaların genomik kütüphaneleri için gerekli klon sayısını göstermektedir. 23

• • • Tablo farklı mikroorganizmaların gen kütüphanelerini oluşturmak için gerekli klon sayısını vermektedir. İnsan ve diğer memeliler için kozmid ya da lamda faj kullanarak yüzbinlerce klon oluşturmak gereklidir. Bu nedenle, memeli kütüphaneleri oluşturmak için gereken klon sayısını azaltma yolları araştırılmaktadır. Çözüm olarak daha büyük DNA fragmentlerinin klonlanabildiği yeni klonlama vektörlerinin dizaynı olabilir.

• • • En popüleri bakteri yapay kromozomları (BAC) dır ve F plazmidine dayanmaktadır. F plazmidi nispeten büyüktür ve bundan türevlenen vektörler normal plazmid vektörlerinden daha yüksek kapasiteye sahiptir. BAC lar 300 kb a kadar DNA ları kabul edebilirler, bu dururmda insan genomik kütüphanesi oluşturmak için sadece 30 000 klon yeterli olacaktır. Diğer yüksek kapasite vektörleri P 1 bakteriyofajından yapılmıştır ve 110 kb a kadar DNA parçaları kapsid yapısına alabilir. P 1 ve BAC vektörlerinin özellikleri birleştirilerek elde edilen vektörler olan P 1 kökenli yapay kromozomlar (PAC) da 300 kb lık kapasiteye sahiptir 25

• YACs: kapasite 1000 kb • HACs: kapasite 26

Diğer bakteriler için vektörler • Klonlama vektörleri Streptomyces, Bacillus, ve Pseudomonas gibi diğer birçok bakteri türü için de geliştirilmiştir. • Bazı vektörler sadece konağa özgü iken bazıları geniş bir konak aralığına sahiptir. • Ancak, genel amaç ve kullanımları bakımından E. coli vektörlerine oldukça benzerdirler. 17 1