Electroforesis Capilar Electroforesis Definicin Tcnica de separacin de

Electroforesis Capilar

Electroforesis Definición: Técnica de separación de moléculas iónicas, de acuerdo a su tamaño y carga, en un campo eléctrico.

Electroforesis v + - q Campo eléctrico E Fuerza eléctrica Eq = fv E = campo eléctrico q = partícula cargada f = coeficiente de fricción v = velocidad Movilidad u = v/E u = movilidad Tamaño y forma de la partícula

Electroforesis

Electroforesis Parámetros que influyen en la movilidad electroforética • Campo eléctrico • Temperatura • Viscosidad • Fuerza iónica • p. H • Carga del soluto • Forma y tamaño del los iones

Electroforesis Instrumentación básica Fase estacionaria: Solutos no iónicos (sacarosa, glicerol) Soporte semisólido (papel, acetato de celulosa, almidón, poliacrilamida, agarosa) “Fase móvil”: Fuente de poder que suministre voltajes de 20 V/cm - 200 V/cm

Electroforesis Instrumentación básica

Electroforesis Aplicaciones Método de separación de: Proteínas Ácidos nucleicos Biomoléculas (insulina, lipoproteínas, enzimas) Permite determinar: Peso molecular de proteínas Punto isoeléctico Distinguir moléculas por su carga neta

Electroforesis Capilar Desventajas de la electroforesis convencional Generación de calor debido al voltaje aplicado limitando la resolución Tiempos de análisis largos Análisis cuantitativo impreciso Difícil de automatizar Voltaje limitado 20 – 200 v/cm

Electroforesis Capilar

Electroforesis Capilar Antecedentes Históricos (1967) Hjerten usa capilares milimétricos para separar iones cargados eléctricamente, favoreciendo así la disipación del calor generado (1979) Virtamen y Makkers: desarrollan separaciones electroforéticas en capilares de 200 μm (1980) Jorgenson y Lukacs generan capilares de silica fundida con diámetros 75 μm. Surge la EC la cual opera a voltajes de 400 – 500 v/cm en cámaras refrigeradas con aire.

Electroforesis Capilar Ventajas frente HPLC Tamaño de muestra: 1 – 10 n. L Tiempos de análisis cortos, 10 – 40 min N = 100 000 – 200 000 Mínimo ensanchamiento de picos Consumo de reactivos reducido

Electroforesis Capilar Característica HPLC Electroforesis convencional EC Volumen de la 2 – 10 μL celda N/A 2 - 10 n. L Volumen de la 2 – 50 μL muestra 1 – 150 μL 500 f. L - 200 μL Automatizació n Completa Baja Completa Sensibilidad ng- μg/mil (UV/Vis) fg – ng/m. L (UV/Vis) μg (azul de Coomassie) Rendimiento Alto Bajo

Electroforesis Capilar Definición: Nanotécnica de separación de moléculas cargadas, en el seno de una solución amortiguadora contenida dentro de un capilar.

Electroforesis Capilar Fundamento: La técnica se basa en la migración diferencial de las partículas cargadas, en sentido y velocidad en un campo eléctrico

Electroforesis Capilar Conceptos básicos Velocidad de migración v = μe · E V = velocidad lineal del ión μe = velocidad electroforética de un ión E = campo eléctrico aplicado (V/cm)

Electroforesis Capilar Conceptos básicos Velocidad electroforética μe= q. E/6πηr q= carga de un ión r = radio de un ión E = campo eléctrico aplicado (V/cm) η = viscosidad de la disolución

Electroforesis Capilar Conceptos básicos Veo = μeo E Veo Velocidad electroosmótica μeo= movilidad electroosmótica 3 4 5 6 p. H 7 8

Electroforesis Capilar Velocidad electroosmótica Si. O- Zona difusa V eo= μeo E Doble capa eléctrica

Electroforesis Capilar Velocidad electroosmótico V = μeo E Dependerá de: p. H, a p. H altos el flujo será mayor que a p. H ácidos Fuerza iónica, a mayor fuerza iónica se reduce el flujo electroosmótico

Electroforesis Capilar Velocidad total del ión Vtotal = (μe + μeo )E= Ve + Veo V electroosmótica V Total = ve + veo V electroforética ++ ++ + + - - -- -- V Total = veo - ve

Electroforesis Capilar Electroferograma: Señal Grafico resultante de una electroforesis capilar ++ + - -- Tiempo

Electroforesis Capilar Tiempo de migración t = L 2/μtotal L = Longitud de la columna μtotal = μe + μeo

Electroforesis Capilar Eficiencia de la Electroforesis Capilar N = μtotal V/2 D D = coeficiente de difusión del soluto en cm 2 s-1 V = voltaje aplicado N (x 10 -5) 3 2 1 > potencial aplicado mayor es N 0 10 20 30 KV

Electroforesis Capilar Resolución R = 2(t 2 -t 1)/W 1 +W 2

Electroforesis Capilar Electroferograma Representación gráfica de las especias separadas por electroforesis capilar.

Electroforesis Capilar Instrumentación básica Capilar de silicie

Electroforesis Capilar Silice fundida recubierto de Poliimida Longitud: 20 – 100 cm Diámetro interno: 20 – 200 μm

Electroforesis Capilar Soluciones llenado del capilar Buffer de Fosfatos Buffer de Boratos Solución de Cromato

Electroforesis Capilar Sistema de detección Detector Limite detección UV/Vis 10 -5 – 10 -6 moles Fluorescencia 10 -7 – 10 -9 Amperométrico 10 -10 – 10 -11 Conductividad 10 -7 – 10 -8 Espectrometría de masas 10 -8 – 10 -9

Electroforesis Capilar Tratamiento preliminar de la muestra Las muestras deben ser previamente centrifugadas y/o filtradas en filtros de 0. 22 - 45 μm

Electroforesis Capilar Métodos hidrodinámicos de inyección Vacío Presión Muestra Efecto sifón Muestra

Electroforesis Capilar Método electrocinético de inyección Muestra 1/3 – 1/5 Voltaje de separación

Electroforesis Capilar Modos de separación Electroforesis Capilar de Zona (CZE) Electroforesis Capilar de Gel (CGE) Isoelectroenfoque Capilar (CIEF) Isotacoforesis Capilar (CITP)

Electroforesis Capilar de Zona (CZE) El capilar esta lleno con una solución buffer La separación de los iones esta influenciada por el flujo electroosmótico Uso de aditivos o modificadores de flujo electroosmótico: detergentes catiónicos

Electroforesis Capilar de Zona (CZE) Cátodo Buffer 1 Buffer 2 Buffer 3 Ánodo

Electroforesis Capilar Aplicaciones CZE Separación de iones

Electroforesis Capilar Aplicaciones CZE Antiinflamatorios

Electroforesis Capilar Aplicaciones CZE Proteínas

Electroforesis Capilar en Gel (CGE) Capilares rellenos con un gel Gel covalentemente unido a la silica (Poliacrilamida, agarosa, polietilenglicol) Gel libre en el capilar Separación esta basada en el tamaño Separación de grandes moléculas como fragmentos de ADN, oligonucleótidos, proteínas

Electroforesis Capilar en Gel (CGE) (+) (-) ++ ++ Gel Migración +

Electroforesis Capilar Isoelectroenfoque (CIEF) Separación de aminoácidos anfóteros La matriz presenta un gradiente de p. H Determinación de punto isoeléctrico de proteínas Orden de migración. 1º proteínas más alcalinas seguidas de las ácidas

Electroforesis Capilar Isoelectroenfoque (CIEF) Cátodo H+ OH- p 1 p 2 p 3 Gradiente de p. H Ánodo

Electroforesis Capilar Puntos isoléctricos de proteínas Proteína p. H Isoeléctrico Pepsina 1. 1 Hemoglobina 6. 8 Caseina 4. 6 Mioglobina 7. 0 4. 78 Ribonucleasa 9. 5 Ureasa 5. 0 Citrocromo c 10. 65 Insulina 5. 3 Lisozima Albumina de huevo 11. 0

Electroforesis Capilar Isoelectroenfoque de proteínas

Electroforesis Capilar Skoog 5ª Ed. Principios de análisis instrumental QD 79 15 S 5. 68 Galen W. Ewing Analytical Instrumental Hadbook. Cap. 25 QH 345 C. 527 Rubinson and Rubinson. Química Analítica Contemporánea. Cap. 14.

Electroforesis Capilar Isotacoforesis Capliar (CITP) Separación independiente de iones o cationes Utiliza un buffer discontinúo La muestra se aplica entre dos buffer

Electroforesis Capilar Isotacoforesis Capilar (CITP) Cátodo Buffer baja movilidad Buffer elevada movilidad 1 2 3 Ánodo

Electroforesis Capilar Aplicaciones Análisis inorgánicos Ácidos orgánicos Aminoácidos, péptidos y proteínas Ácidos nucleicos y oligonucleotidos Carbohidratos y oligosacáridos Clínica Farmacología

Electroforesis Capilar Principios de análisis instrumental Skoog 5ª Ed QD 79 15 S 5. 68 Analytical Instrumental Hadbook. Cap. 25 Galen W. Ewing QH 345 C. 527