SEMINARIOS BIOQUMICA I Cromatografa ELECTROFORESIS ADN Recombinante http

SEMINARIOS BIOQUÍMICA I • Cromatografía • ELECTROFORESIS • ADN Recombinante http: //minnie. uab. es/~veteri/21206/S. II_electroforesis_09. ppt

INTRODUCCIÓN ELECTROFORESIS Separar y analizar moléculas: Arne Tiselius 1937 (Nobel 1948) proteínas ADN/ARN . . . en función de su diferente movilidad al aplicar un campo eléctrico (dependerá de su carga eléctrica) cátodo ánodo * Moléc. (+) polo (-) o cátodo * Moléc. (-) polo (+) o ánodo ELECTROFORESIS LIBRE moléculas en disolución o suspensión: poco resolutiva SOPORTE cátodo ánodo ELECTROFORESIS DE ZONA SOPORTE que retiene las moléculas: elevado poder de resolución

EQUIPO ELECTROFORÉTICO fuente de alimentación cátodo ánodo - electrodo Componentes: cable muestra gel + electrodo cubeta * Dos electrodos ánodo (+) cátodo (-) tampón muestra electrodo (E. horizontal) * Cubeta cátodo - * Tampón de electroforesis cubeta cable ánodo + gel fuente de alimentación (E. vertical) * Fuente de alimentación tampón * Soporte electroforético (gel)

FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS 1_ Campo eléctrico *Diferencia de potencial: voltaje (V-voltios) *Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica depende de V y de R (Ley de Ohm V=Rx. I) *Resistencia (R-ohmios): determinada por el soporte y tampón electroforesis *Temperatura: efecto Joule refrigerantes 2_ Muestra *Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la molécula *Tamaño *Forma: formas globulares avanzan más 3_ Tampón de electroforesis *p. H: determina la carga de las moléculas generalmente es ligeramente básico moléculas (-) *Fuerza iónica: moderada (0. 05 o 0. 1 M) para que no interfiera 4_ Soporte

SOPORTE ELECTROFORÉTICO Características Gel poroso (entramado tridimensional interno) Tiene que permitir el paso de moléculas Material inerte: NO puede estar cargado y no debe adsorber las moléculas de la muestra Tipos de Soporte Gel poroso ü No restrictivo (Tipo I): Tamaño poro >>> moléculas, no opone impedimento a su paso separación sólo por CARGA * Electroforesis de proteínas: • Acetato de celulosa, papel, almidón, agar ü Restrictivo (Tipo II): Tamaño poro ≈ moléculas, opone resistencia a su paso separación por tamaño (tamizado molecular) * Electroforesis de proteínas: • Separación por CARGA y TAMAÑO • Acrilamida * Electroforesis de DNA/RNA: • Separación sólo por TAMAÑO • Agarosa, acrilamida

EN ACETATO DE CELULOSA: PROTEINOGRAMA Soporte: (no restrictivo) Tiras de acetato de celulosa Electroforesis horizontal muestra Strip + Avance de las proteínas - Campo eléctrico (DV) 1. Aplicación de la muestra 2. Electroforesis 3. Detección por tinción: Azul de Coomassie Negro amido 4. Densitometría Aplicaciones diagnósticas en serología (separación proteínas séricas)

EN ACETATO DE CELULOSA: PROTEINOGRAMA Feline: Feline Infectious Peritonitis Feline: Lymphosarcoma Canine: Leishmaniosis Equine: Chronic Hepatitis Equine: Inmunodeficiency + Pneumonia

EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE) Soporte: (restrictivo) Gel de Poliacrilamida * Polimerización de dos componentes: Acrilamida + Bisacrilamida * Variación de la concentración variación del tamaño de poro [poliacrilamida] Electroforesis vertical 1. Preparación del gel 2. Montaje de la cubeta 3. Aplicación de la muestra 4. Electroforesis 5. Detección por tinción: Azul de Coomassie Sales de plata tamaño poro

EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE) Ventajas: * Gran poder de separación por CARGA y por TAMAÑO * Químicamente inertes * Transparentes (permite densitometría) * Estables (p. H, fuerza iónica, temperatura) * Versatilidad en cuanto al tamaño de poro y entramado uniforme Aplicaciones: * Separar proteínas * Determinar peso molecular de una proteína * Separar proteínas oligoméricas SDS-PAGE * Separar proteínas en función de su p. I Isoelectroenfoque * Separar proteínas de mezclas muy complejas Electroforesis 2 D * Ver si hay una proteína en concreto Western Blot

SDS-PAGE Condiciones de la PAGE: * No desnaturalizantes: separamos por CARGA y TAMAÑO PAGE * Desnaturalizantes: separamos sólo por TAMAÑO SDS-PAGE Agentes desnaturalizantes: SDS (dodecilsulfato sódico), urea, reductores (DTT, b-mercaptoetanol). . . • SDS: detergente aniónico (-), dota a todas las proteínas de carga (-) todas migrarán hacia el ánodo (+), separándose sólo por tamaño + SDS S-S S-S PM = 50 k. Da - - -- -- --- - - S-S -- + SDS + DTT - --- - --- - 25 k. Da 44 k. Da

SDS-PAGE: determinación del peso molecular Marcadores de peso molecular: * Mezcla de diferentes proteínas pre -teñidas de las que conocemos el peso molecular. * Por comparación podemos averiguar el PM de nuestra proteína.

ISOELECTROENFOQUE * Separación de proteínas según su punto isoeléctrico (p. I) p. I es el valor de p. H en el que la carga de la proteína = 0 si p. H > p. I: carga (–) si p. H < p. I: carga (+) * Gel de poliacrilamida (PAGE) con gradiente de p. H. + A B + Proteínas migran hasta la zona del gel donde p. H=p. I de la proteína + + GRADIENTE DE p. H 2 (ácido) + A B + 0 A p. H 6 0 B 0 p. H 10 (básico) - - - p. H 7 Prot A p. I=6 Prot B p. I=7

ELECTROFORESIS 2 D * 1ª dimensión: ISOELECTROENFOQUE separa por p. I * 2ª dimensión: SDS-PAGE separa por PM 1ª DIMENSIÓN 2ª DIMENSIÓN

ELECTROFORESIS 2 D

WESTERN BLOT * Técnica immunológica interacción PROTEÍNA-PROTEÍNA (Ag-Ac) * Detectar en una mezcla una proteína concreta mediante el uso de anticuerpos específicos (muy sensible) 1. SDS-PAGE Electroforesis 3. Incubación con los Anticuerpos 2. Transferencia a membrana proteínas 2 dario HRP 1 ario proteína interés Resultado SDS-PAGE Western BLOT 4. Revelado proteína interés Todas las proteínas Proteína de interés SUSTRATO HRP PRODUCTO LUZ

WESTERN BLOT * Técnica immunológica interacción PROTEÍNA-PROTEÍNA (Ag-Ac) * Detectar en una mezcla una proteína concreta mediante el uso de anticuerpos específicos (muy sensible). SDS-PAGE: Resultado SDS-PAGE Western BLOT WESTERN BLOT: Todas las proteínas Proteína de interés

ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS Soporte: (restrictivo) * Gel de Agarosa moléculas grandes (0. 1 -60 kpb) * Gel de Poliacrilamida moléculas pequeñas (6 -2000 pb) Electroforesis horizontal (agarosa) o vertical (poliacrilamida) Separación sólo por TAMAÑO Densidad de carga igual para todas las moléculas por los grupos fosfato Ácidos nucleicos = carga (-)

ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS Aplicaciones: * Separar, identificar y purificar fragmentos de DNA o RNA * Determinar tamaño de un fragmento de DNA * Separación de cromosomas enteros Gel de agarosa * Secuenciación de DNA * Identificación de regiones de unión a proteínas Gel de poliacrilamida * Detectar la presencia de un gen (o secuencia específica de DNA) en una muestra Southern Blot * Determinar si se expresa un gen específico Northern Blot

EN GEL DE AGAROSA Soporte: (restrictivo) Gel de agarosa Electroforesis horizontal muestra (-) - + Campo eléctrico (DV) 1. 2. 3. 4. Preparación del gel Aplicación de la muestra Electroforesis Detección por tinción con Bromuro de Etidio (Br. Et): se intercala en el DNA y al irradiarlo con luz UV emite fluorescencia

SOUTHERN BLOT * Interacción DNA-DNA (hibridación por complementariedad de cadena) * Detectar en una mezcla una secuencia de DNA concreta mediante el uso de sondas de DNA específicas (muy sensible) * Detectar la presencia de un gen, etc. 1. Electroforesis en gel de agarosa 3. Hibridación con la sonda radioactiva 2. Transferencia a membrana moléculas de DNA Sonda de DNA moléculas de DNA 32 P …TAACGT… …ATTGCA… Resultado Gel Agarosa Southern BLOT 4. Revelado DNA interés 32 P Todos los DNA de interés DNA interés

NORTHERN BLOT * Interacción RNA-DNA (hibridación) * Detectar en una mezcla una secuencia de RNA concreta mediante el uso de sondas de DNA específicas (muy sensible) * Expresión génica 1. Electroforesis en gel de agarosa 3. Hibridación con la sonda radioactiva 2. Transferencia a membrana moléculas de RNA Sonda de DNA moléculas de RNA 32 P …TAACGT… …AUUGCA… Resultado Gel Agarosa Northern BLOT 4. Revelado RNA interés 32 P Todos los RNA de interés RNA interés

Links a simulaciones de electroforesis: - En tira de acetato de celulosa: http: //sebbm. bq. ub. es/Bio. ROM/contenido/biomodel/lab/acetato/inicio. htm - En gel de poliacrilamida http: //biomodel. uah. es/lab/sds-page/inicio. htm - En gel de agarosa: http: //biomodel. uah. es/biomodel-misc/anim/elfo/gel_electrophoresis. swf http: //biomodel. uah. es/biomodel-misc/anim/elfo/electrof. html