ELETROFORESE CAPILAR Determinao de ctions em gua de

ELETROFORESE CAPILAR Determinação de cátions em água de coco

ELETROFORESE É um método de separação baseado na migração diferenciada de espécies iônicas ou ionizáveis através da aplicação de um campo elétrico. Desenvolvida por Anne Tiselius em 1930 e utilizada para estudo de proteínas em soro sangüíneo. MEIOS: PAPEL, AMIDO, AGAROSE, ACETATO DE CELULOSE, GEL DE POLIACRILAMIDA, etc

BASES PARA A SEPARAÇÃO A velocidade de migração de uma dada espécie depende da sua carga e do seu tamanho. As separações são baseadas nas diferenças das relações carga/tamanho dos vários analitos presentes em uma amostra. Comparação entre íons de mesma carga e de mesmo tamanho

Velocidade de Migração (cm s-1) v = e E Campo elétrico (V cm-1) Mobilidade eletroforética (cm 2 V-1 s-1) Se duas espécies diferirem na carga ou nas forças de atrito, elas se separarão ao se moverem através do tampão sob a ação do campo elétrico. Potencial aplicado Pode ser reescrita como v = e V L Comprimento

CARACTERÍSTICAS DOS CAPILARES Usualmente, sílica fundida (-Si. OH) recoberta de poliimida • dimensões 15 a 100 µm de diâmetro interno • 50 a 100 cm de comprimento • boa resistência mecânica (devido à poliimida) • alta resistência elétrica do eletrólito contido (permite campo elétrico de 100 a 500 V/cm) • boa dissipação de calor (razão área/volume alta), necessária por causa do efeito Joule • separações de alta eficiência (105 pratos teóricos) • pequeno consumo de amostra (1 a 10 n. L) e de tampão

SISTEMA PARA ELETROFORESE CAPILAR DISPOSITIVO PARA CONTROLE DE TEMPERATURA CAIXA DE ACRÍLICO CAPILAR FONTE DE ALTA TENSÃO DETECTOR ELETRODO RESERVATÓRIO PARA O ELETRÓLITO

FUNCIONAMENTO DA CE + -

++ -- -+ -- + ++ ++ ++ - + + - Amostra Injeção da amostra Tampão

- + --++-- +++ + -- + Aplicação Tampão do potencial Tampão

+ ++ ++ + --- -- - Tampão Processo de separação Tampão

- + ++ ++ -- -- Tampão - Processo de separação Tampão

- + ++ ++ -- -- Tampão - Processo de separação Tampão

+ + + -- -- Tampão ++ ++ - Processo de separação Tampão

TIPOS DE INJEÇÃO • Injeção da amostra • Pressão • Eletrocinética

INJEÇÃO POR PRESSÃO x ELETROCINÉTIC Por pressão Não discrimina quanto à mobilidade do íon. Injeção mais representativa da amostra. Eletrocinética Discrimina a injeção de quantidades maiores de íons com maior mobilidade

FLUXO ELETROOSMÓTICO

Veletroforética V total ++ + + -- Veletroosmótica V total = V eletroosmótica + V eletroforética -

SISTEMAS DE DETECÇÃO MODOS DE DETECÇÃO LIMITES DE DETECÇÃO TÍPICOS, mol/L ABSORB NCIA direta indireta 10 -5 - 10 -6 10 -4 - 10 -5 FLUORESCÊNCIA direta (lâmpada) direta (laser) indireta 10 -7 - 10 -8 10 -9 - 10 -12 10 -6 - 10 -7 RAMAN 10 -6 - 10 -7 ÍNDICE DE REFRAÇÃO direto (laser) 10 -5 - 10 -6 CONDUTIVIDADE 10 -5 - 10 -6 AMPEROMETRIA 10 -8 - 10 -9 ESPECTROMETRIA DE MASSAS 10 -4 - 10 -9 RADIOMETRIA 10 -9 - 10 -11

PREPARO DOS PADRÕES Preparar, por diluição apropriada a partir de soluções estoque 1000 µmol L-1, 1, 00 m. L de soluções padrão contendo as seguintes concentrações das espécies K+ Ca 2+ Mg 2+ Na+ Li+ Padrão 1 50 10 10 10 50 Padrão 2 100 20 20 20 50 Padrão 3 200 40 40 40 50 Padrão 4 250 50 50 Padrão 5 300 60 60 60 50 * Concentrações em µmol L-1

PREPARO DA AMOSTRA Em um vial de 1, 5 ml adicionar 5 µL da amostra de água de coco, 75 µL de uma solução 1 m. M em Li+ e completar o volume para 1, 5 ml. Injetar a amostra de água de coco e obter o eletroferograma.

ESTUDO DE PAR METROS INSTRUMENT Com a solução padrão 3, estabelecer o efeito das seguintes variáveis: 1. Tipo de injeção (Hidrodinâmica e eletrocinética) 2. Tempo de injeção 3. Tensão aplicada ( 10, 15, 20, 25 e 30 k. V )

DETERMINAÇÃO DE CÁTIONS EM ÁGUA DE COCO • Tampão de corrida: MES (30 m. M) , Histidina (30 m. M), p. H 6. • Voltagem: 25 k. V • Injeção Hidrodinâmica: 10 cm/10 s • Capilar de Sílica fundida: 60 cm e 75 m de diâmetro interno • Padrão Interno: 50 µM Li+ Eletroferograma de uma solução padrão de potássio (1), bário (2), cálcio (3), sódio (4), magnésio (5) e lítio (6).

CURVA DE REFERÊNCIA

INJEÇÃO POR PRESSÃO Diferença de pressão h elevação da extremidade P pressurização da amostra vácuo aplicação de vácuo na extremidade do detector

INJEÇÃO ELETROCINÉTICA Um potencial é aplicado, por um tempo determinado, fazendo com que a amostra penetre no capilar através de um processo que combina a migração iônica e o fluxo eletroosmótico +