Eletroforese Capilar Eletroforese capilar em zona Eletroforese capilar

Eletroforese Capilar • Eletroforese capilar em zona • Eletroforese capilar em gel • Isotacoforese capilar • Focalização isoelétrica capilar • Cromatografia eletrocinética capilar micelar

- - -- -- - - --- - - - - Dados: A: 500 cargas e raio hidratado 500 UA B: 1000 cargas e raio hidratado 1000 UA Importante: neste exemplo, as cargas das moléculas não dependem do p. H.

Qual a ordem de migração dos íons Li+, Na+, K+, Rb+? Massa atômica: Li: 7; Na: 23; K: 39; Rb: 85 H Li Na K Rb Cs Fr Li Na K Rb Rb 600 pm 500 pm 300 pm 250 pm K Na Tempo, min Li

Detecção Injeção Sinal do detector - tm(1) ----- -- - tm(2) Tempo tm(3) tm(4) +

Sabendo que as massas moleculares são: tm(1) = 10 minutos; MM = 500 tm(2) = 11, 56 minutos; MM = 1000 tm(3) = 15, 1 minutos; MM = 5000 tm(4) = 18 minutos; MM = 15000 Qual a massa molecular de um composto que apresenta tempo de migração de 13, 5 minutos ?

Sendo o y = log MM, e o x = tempo log MM = 0, 1861 x 13, 5 + 0, 8505 log MM = 3, 36885 MM = 103, 36885 = 2338

varia entre um líquido viscoso e um “sólido” Géis Substituíveis (Físicos) Gel Géis Fixos (Químicos)

Gel Químico Gel Físico • Possui ligações cruzadas e com a parede do capilar; • Estrutura de póros bem definida; • O tamanho dos póros não varia após a polimerização; • Partículas danificam o gel; • Apresenta alta resolução dos analitos; • Não substituível. • Não apresenta ligações cruzadas ou com a parede do capilar; • Redes poliméricas enoveladas; • Estrutura de póros dinâmica; • O tamanho dos póros pode variar; • Partículas podem ser removidas facilmente; • Pode ser substituído.

Moléculas menores DNA RNA Proteínas [ CH 2 CH ]n C O NH 2 Agente crosslinking: N, N’-metilenobisacrilamida %T: concentração total de polímero %C quantidade de ligações cruzadas %T diminui o tamanho dos póros %T aumenta o tamanho dos póros

• usualmente de 3 a 6 % de T com 5 % de C; 30 milhões de pratos/ m

Problemas associados aos géis fixos de poliacrilamida: • Instabilidade dos géis, que podem ser “arrastados” para fora do capilar devido ao fluxo eletrosmótico • Formação de bolhas durante o preparo do gel Minimização destes efeitos: • Utilização de capilares revestidos, a fim de minimizar ou eliminar o fluxo eletrosmótico; • As soluções de preparo do gel devem apresentar alta pureza e passarem por degaseificação. Em géis fixos a injeção deve ser eletrocinética. Por quê? Qual problema pode ocorrer quando a injeção eletrocinética é utilizada?

• Utilizado acima da temperatura de geleificação, por exemplo 40 C • O gel de agarose é caracterizado por possuir póros grandes • É o meio de escolha para a separação de moléculas de DNA de tamanho relativamente grande • Apresenta baixa absortividade em 260 nm Moléculas maiores DNA RNA

• UV/Vis; • Espectroscopia de Massas; • Fluorescência: detecção indireta ou intercaladores fluoróforos. através de

DNA Proteínas Polissacarídeos Polímeros sintéticos

Condição desnaturante: uréia (7 a 9 mol L-1) A ordem de migração é dada pelo número de bases Exemplo: sequenciamento de DNA Condição não desnaturante: A ordem de migração é dada pela relação carga/ área superficial Exemplo: separação de fragmentos de restrição, produtos de PCR

Gel de poliacrilamida de ligação cruzada, 260 nm

31 69 43 85 58 97 Gel de poliacrilamida de ligação cruzada, CE-LIF

Ciência Forense Conservação de espécies Descoberta de drogas. . . Análise Filogenética

Antes da desnaturação ME Após a desnaturação

Massa Molecular 30000 14400 45000 20100 10 12 14 16 18 20 22 97000 66000 24 26 28 min Condições de análise: capilar 32 cm; tensão -15 k. V; injeção 900 mbar durante 0, 1 min; detecção 210 nm; eletrólito 12% dextran, 0, 4 mol L-1 Tris/Borato, p. H 8, 5, 0, 1% SDS, (Proteínas desnaturadas segundo protocolo Pharmacia®).