ELECTROFORESIS Mtodo de separacin de protenas en disolucin

ELECTROFORESIS Método de separación de proteínas en disolución cuando se las somete a un campo eléctrico estacionario ● Al cerrar el interruptor aparece un campo eléctrico. Las proteínas están cargadas y aparece una fuerza eléctrica que las hace moverse. Debido a la diferente masa, unas proteínas se desplazan más que otras.

ELECTROFORESIS (II) Al aplicar un campo eléctrico aparece sobre las proteínas una fuerza eléctrica ●

ELECTROFORESIS (III) ● La fuerza eléctrica es algo menor: Además de la fuerza eléctrica aparece una fuerza viscosa, que se opone al movimiento y hace que se alcance una velocidad límite: ● Velocidad límite Coeficiente de fricción molecular

ELECTROFORESIS (IV) ● El coeficiente de fricción molecular es: Radio efectivo de la MICELA Viscosidad del fluido La capacidad de la MICELA para moverse se representa por la MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA, u: ●

ELECTROFORESIS (V) La capacidad de la MICELA para moverse se representa por la MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA, u: ● Depende de: q': Carga aparente que a su vez depende del tamaño de la proteína, de la T y de la fuerza iónica ● factor de forma de la proteína: 6 R' Depende de ● coeficiente de viscosidad del medio: ●

ELECTROFORESIS (VI) Tipos y aplicaciones Electroforesis libre o de Frontera ●Separación e identificación de las proteínas de una mezcla ●Medida de la concentración de las distintas proteínas de la mezcla ●Determinar la movilidad electroforética de una proteína ● Electroforesis de zona ●Las mismas que la electroforesis libre ●Extracción de proteínas de una mezcla ●

ELECTROFORESIS (VII) Electroforesis libre o de Frontera Aparato de Tiselius (I) ELECTRODOS Frontera entre la disolución de proteínas y la disolución tampón DISOLUCIÓN TAMPÓN TUBO DE ELECTROFORESIS El sistema se encuentra a T constante para evitar corrientes de convección

ELECTROFORESIS (VIII) Electroforesis libre o de Frontera Aparato de Tiselius (II)

ELECTROFORESIS (IX) Electroforesis libre o de Frontera Aparato de Tiselius (III) Elección cuidadosa del medio en el que disolvemos las proteínas ● p. H: Condiciona la ionización de las proteínas (movilidad) ● Disolución tampón: Para mantener el p. H constante y conocer ● con precisión la fuerza iónica de la disolución D. D. P utilizada: Debe ser lo mayor posible, pero sin que la ● cantidad de calor liberada (Efecto Joule) altere las proteínas

ELECTROFORESIS (X) Electroforesis libre o de Frontera Análisis cualitativo de una mezcla ● El diagrama electroforético consta de una serie de picos, cada uno de los cuales corresponde a una movilidad diferente. Comparando con patrones podemos identificar las distintas proteínas presentes en la mezcla.

ELECTROFORESIS (XI Electroforesis libre o de Frontera Análisis cuantitativo de una mezcla ● Diagrama electroforético: Gradiente de concentración frente a posición El área bajo un pico respecto al área total da la concentración de dicha proteína

ELECTROFORESIS (XII) Electroforesis libre o de Frontera Medida de la movilidad electroforética (Disolución con 1 proteína) ● ● Se realizan dos diagramas electroforéticos separados un intervalo de tiempo. Cálculo de la velocidad límite ● ● Cálculo eléctrico del campo

ELECTROFORESIS (XIII) Electroforesis de zona La migración de las proteínas se realiza sobre un medio rígido (papel o gel), lo que permite separarlas en zonas bien diferenciadas, pudiendo ser extraidas por elución. ● ● Permite trabajar con cantidades pequeñas ● Permite separar compuestos ionizables de masa molecular pequeña: aminoácidos, nucleótidos, . . .

ELECTROFORESIS (XIV) Electroforesis de zona

ELECTROFORESIS (XV) Electroforesis de zona Tipos Electroforesis sobre papel: el medio rígido es un papel de filtro empapado en la disolución tampón sobre el que se coloca la disolución de proteínas. ● Electroforesis sobre gel: el medio rígido es un gel (almidon, ● acetato, . . . ) sobre el que se coloca la disolución de proteínas.

ELECTROFORESIS (XVI) Electroforesis de zona

ELECTROFORESIS (XVII) Electroforesis de zona Baño térmico Tiras de gel Fuente de alimentación Electrodos

ELECTROFORESIS (XVIII) Información más avanzada: http: //webpages. ull. es/users/fcorzo/electroforesis/indice. htm ● Curso de Doctorado de la Univ. De la Laguna ● http: //iqb. fcien. edu. uy/pdf/electroferosis. pdf ● Notas sobre electroforesis ● http: //www. amershambiosciences. com ● Empresa de productos para laboratorio ●

ELECTROFORESIS Método de separación de proteínas en disolución cuando se las somete a un campo eléctrico estacionario ● - + E