PROTENAS 1 PROTENAS Polmeros de resduos de aminocidos

PROTEÍNAS 1

PROTEÍNAS Polímeros de resíduos de aminoácidos Único macronutriente que contêm N São sólidos incolores e cristalinos Sabor amargo ou sem sabor Solúveis em água mas insolúveis em solventes orgânicos principalmente com baixa polaridade Maioria 2

PROTEÍNAS São geralmente solúveis em soluções diluídas de ácidos e bases Em soluções aquosas apresentam alto momento dipolar Íon dipolar neutro 3

PROTEÍNAS Reações químicas podem envolver os grupos amínico, carboxílicos ou outros grupos das cadeias laterais que sejam reativos, tais como as sulfidrilas ou hidroxilas Podem, algumas reações, envolver mais de um grupo reativo. 4

KJELDAHL N total Cuidado substâncias não protéicas Sais de amônio, bases purínicas Mesmo em pequenas quantidades podem prejudicar a exatidão da determinação 5

KJELDAHL Baseado: Combustão da amostra pelo aquecimento com ácido sulfúrico concentrado na presença de metais e outros catalizadores Redução do N orgânico da amostra para sulfato de amônio e depois amônia a qual é retida em solução como sulfato de amônio. Material digerido é alcalinizado e destilado para amônia ser capturada em ácido bórico Titulação da amônia com solução de ácido sulfúrico NH 4+ Predomina em meio ácido NH 3 Predomina em meio básico 6

KJELDAHL Podem ser realizadas adaptações ao método com melhoria dos equipamentos e de escalas, semimicro e micro, aparelhos mecanizados e automatizados. Reação entre a amônia e reagente de Nessler para determinação de N em amido Reação de Betheot- cor verde brilhante formada pela reação de amônia com uma solução alcalina (salicilato de sódio, nitroprussiato e dicloroisocianurato) Podem ser utilizados equipamentos automatizados. 7

KJELDAHL Pode ser detectado N inorgânico como por exemplo nitratos e nitrito – não dá para saber a proporção exata 6, 25 – fatores são baseados na média de N contido nas proteínas encontradas nos alimentos (16%) 12 a 19% de proteína Análise de aminoácidos 8

KJELDAHL • • • Leveduras 15% do nitrogênio está na forma de ácidos nucléicos Carne de tubarão e peixes cartilaginosos pode apresentar 3% de uréia Tratamento com TCA para precipitação das proteínas antes de realizar a dosagem do N Calibração de instrumentos são realizadas a partir do Kjeldahl Desvantagem é que não mede a proteína verdadeira 9

DESTILAÇÃO DIRETA Asparagina e glutationa reagem com amidas desprendendo amônia quando destilado com solução forte de hidróxido de sódio Pode ser realizada destilação direta para alguns materiais Trigo e cevada, carnes, fermentação, estocagem de cereais Tempo X exatidão 10

COLORIMÉTRICOS Orange II Grupos SO 3 H Ligam as cadeias laterais da lisina, histidina e arginina Intensidade de cor Laticíneos e cereais 11

COLORIMÉTRICOS Reação de biureto-coloração púrpura Reação entre íons cúpricos em p. H alcalino Propanol + calor - melhora Lactose é interferente Sensibilidade entre 1 a 10 miligramas Análises bioquímicas são mais utilizados 12

COLORIMÉTRICOS Método de Lowry Análise bioquímicas e automatizadas 10 vezes mais sensível que o biureto Substâncias contendo ligações peptídicas e aminoácidos aromáticos reduzem o reagente de Folin Influência de fenóis, mercaptoetanol, K+, EDTA e NH 4+ 13

INFRAVERMELHO Análise rápida Equipamentos automáticos Leite, grãos e outros alimentos sólidos Calibração 14

ULTRAVIOLETA 280 nm Baseia-se na absorção dos aminoácidos triptofano, tirosina e fenilalanina Interferência de ácidos nucléicos 15

AMINOÁCIDOS Cromatografia de troca iônica e HPLC Preparação da amostra Padrões de aminoácidos para comparações Homogeneizadas, desengorduradas e secas Teor de proteína na amostra 16

AMINOÁCIDOS Degradação das proteínas e peptídeos Hidrólise ácida – aminoácidos alifáticos são liberados mais lentamente que outros Hidrólise a 110 o. C por 24, 48 e 72 horas Ácidos aspártico, treonina, serina, ácido glutâmico, prolina, glicina, alanina, valina, metionina, isoleucina, fenilalanina, histidina, lisina, arginina 17

AMINOÁCIDOS Perdas de treonina e serina podem ser de 5 a 10% respectivamente Extrapolação linear de valores Tirosina é determinada após 24 horas Isoleucina e valina após 72 horas Maioria dos aminoácidos podem ser obtidos por cálculo dos resultados de 24, 48 e 72 horas 18

AMINOÁCIDOS Não podem ser determinados a cisteína e o triptofano Triptofano – digestão alcalina (mais rápida e efetiva) ou hidrólise enzimática Realizada sob vácuo seguida por cromatografia de troca iônica Cisteína deve ser previamente oxidada com ácido perfórmico para formação de um derivado mais estável, o ácido cistéico 19

AMINOÁCIDOS Para prevenir possível oxidação da metionina é sugerida a adição de 2 -mercaptoetanol a 6 N HCl antes da hidrólise Alguns preferem determinar a metionina como metionina sulfona após tratamento com perfórmico Resultados semelhantes 20

AMINOÁCIDOS DISPONIBILIDADE Digestão com enzimas Reação colorimétrica de aminoácidos Lisina – 346 nm Metionina – 510 nm 21

DIGESTIBILIDADE “IN VITRO” Método mais rápido e barato que a experimentação animal Mede a extensão da hidrólise da proteína Utilizam enzimas proteolíticas para correlacionar com a digestão da proteína “ in vitro” imitando a digestão humana 22