Corso teoricopratico finalizzato allo sviluppo continuo professionale Trichine

Corso teorico-pratico finalizzato allo sviluppo continuo professionale Trichine nelle carni e controllo ufficiale Regolamento (CE) n. 2075/2005 Ravenna 12 Dicembre 2007 giuseppe. merialdi@bs. izs. it

Regolamento (CE) N. 2075/2005 Allegato 1 METODI DI RILEVAMENTO

Altri documenti rilevanti n Commissione Internazionale sulla Trichinellosi (2000) n n Raccomandazioni sui metodi per il controllo di Trichinella negli animali domestici e selvatici destinati al consumo umano European Commision (2001) n Opinion Of the Scientific Committee on Veterinary Measures relating to Pubblic Health on Trichinellosis, epidemiology, methods of dectection an Trichinellafree pig production

Altri documenti rilevanti n Laboratorio Comunitario di Referenza per i Parassiti, ISS (2006) n Guideline for the detection of Trichinella larvae at the slaughterhouse or connected laboratory in a Quality Assurance System

Campioni n Suino 1 grammo dal pilastro del diaframma n 2 grammi per scrofe o verri n 2 grammi altri punti diaframma o mascella, lingua, muscoli addominali (4 g per scrofe o verri) n Altri muscoli 5 grammi n n Equino n 10 grammi di lingua o massetere

Siti di predilezione Suini domestici Cavalli Cinghiali Volpe Diaframma, lingua, massetere Lingua, massetere, diaframma Lingua, diaframma, muscoli arto anteriore Lingua, muscoli arto anteriore

Metodi di rilevamento n Metodo di riferimento n n Metodo dell’agitatore magnetico con digestione artificiale di campioni aggregati Metodi equivalenti Digestione artificiale e sedimentazione (Stomacher) n Digestione artificiale e filtraggio n Digestione automatica fino a 35 g (Trichomatic) n

Metodi di rilevamento n Tutti i metodi di rilevamento (ad eccezione dell’esame trichinoscopico), si basano sullo stesso principio Digestione cloro-peptica del muscolo n Evidenziazione delle trichine liberate dalla digestione n n Variano le tecniche di digestione e di rilevazione

Metodo di riferimento: agitatore magnetico (allegato 1, capitolo 1) n n 100 grammi (100 campioni di suino o 20 di equino) Digestione cloropeptica tramite agitatore magnetico Sedimentazione del digerito Osservazione di un sedimento liquido n n n Tempi di esecuzione 1, 5/ 2 ore Difficoltà tecnica di esecuzione: bassa Costo attrezzature: basso Costo manutenzioni: basso Impegno di personale: alto

Metodo equivalente con filtrazione (allegato 1, capitolo 2, B) n n 100 grammi (100 campioni di suino o 20 di equino) Digestione cloro-peptica tramite stomacher Filtrazione e Sedimentazione accelerata da vibrazioni Osservazione di un sedimento liquido n n n Tempi di esecuzione 1 ora circa Difficoltà tecnica di esecuzione: alta Costo attrezzature: intermedio Costo manutenzioni: intermedio Impegno di personale: alto

Metodo equivalente con digestione automatica (allegato 1, capitolo 2, C) n n Tempi di esecuzione 15 -20 minuti per 35 campioni n Difficoltà tecnica di esecuzione: bassa 35 grammi massimo Digestione e filtrazione automatica Osservazione di un filtro n Costo attrezzature: non disponibili nuove attrezzature n Costo manutenzioni: elevato n Impegno di personale: basso

Esame trichinoscopico (non rientra fra i metodi equivalenti)

Metodi di rilevamento n Esame trichinoscopico n Possibile utilizzo transitorio fino al 31/12/2009 per suino o cinghiali Meno di 15 suini al giorno n Esclusione bollo CEE n Trattamento inattivamente le Trichine n

Metodi di rilevamento n Esame trichinoscopico: limiti n n Permette di osservare solo le Trichine incistate n Non Trichinella pseudospiralis E’ meno sensibile dei metodi con digestione anche per le forme incistate Per ogni animale vanno eseguite almeno 56 osservazioni microscopiche (almeno 6 minuti per osservare un un preparato) Limite massimo 840 osservazioni al giorno pari a 15 suini per operatore

Metodi di rilevamento SENSIBILITA’ Metodo Larve EFFICIENZA Numero suini testati in 2 ore Metodo di riferimento ed equivalenti 3/100 g Almeno 100 Esame trichinoscopico 1/g 2 circa

Metodi innovativi n Sono metodi non ufficiali: Già sviluppati in corso di validazione n In corso di sviluppo n Indiretti: ricerca anticorpi da siero (metodi sierologici) n Diretti: ricerca Trichinella nel muscolo (PCR) n

Metodo di riferimento PRINCIPI, STRUMENTI, REAGENTI E PROCEDURA

Metodo di riferimento: agitatore magnetico n Principio n Comune a tutti i metodi ad eccezione del trichinoscopico n Utilizzo di “un succo gastrico artificiale” (a base di acido cloridrico e tripsina) per digerire il tessuto muscolare n Tempo e temperatura sotto controllo n Le cisti muscolari si rompono e le trichine vengono rilasciate n Concentrazione delle larve per sedimemtazione e loro osservazione microsopica

Trichinella incistata nel muscolo Trichinella nel liquido di digestione

Metodo di riferimento: agitatore magnetico n Strumentazione molto semplice Bilancia (digit 0, 1) n Sminuzzatore tipo Moulinex o Minipimer n Termometro a mercurio o a sonda n Agitatore termoriscaldato n Imbuti, cilindri, supporti, pipette, piastre Petri n Steromicroscopio n Costo del laboratorio: 2000 € circa n

Metodo di riferimento: agitatore magnetico n n Reagenti Pepsina 1: 10. 000 NF corrispondente a 1: 12 500 BP n n n Pepsina : 1 Kg costa 500 €, ogni pool da 100 g sono 5 € Conservare in luogo fresco asciutto Mantenere etichetattura Possibile utilizzare formula liquida 660 EP unità/ml Acido Cloridrico 25% n A partire dal comunemente reperibile 37% applicare la proporzione n n 37: 100=25: X Aggiungere lentamente 67, 5 ml di HCl 37% a 32, 43 ml di acqua distillata

Metodo di riferimento: agitatore magnetico n FASE 1: preparazione aggregato Suino 100 campioni da 1 g n Equino 20 campioni da 5 g n E’ possibile aggiungere 15 grammi ad una serie completa (15 suini e 3 equini) n Se l’aggregato inferiore o uguale a 50 grammi si utilizzerà metà del liquido di digestione n Utilizzo della bilancia n

Metodo di riferimento: agitatore magnetico n FASE 2: sminuzzamento

Metodo di riferimento: agitatore magnetico n FASE 3: Preparazione liquido di digestione Preparare 2 litri di acqua preriscaldata a 4648°C n Aggiungere 16 ml di HCl 25% n Introdurre barra di agitazione n Aggiungere 10 g di pepsina n Se aggregato ≤ 50 grammi dimezzare tutto n

Metodo di riferimento: agitatore magnetico n FASE 4: digestione n Trasferire nel becher la carne sminuzzata n L’agitatore magnetico deve mantenere il agitazione a temperatura controllata n Controllare con termometro 44 -46°C n Tempo di digestione 30 minuti salvo eccezioni

Metodo di riferimento: agitatore magnetico n n n FASE 5. sedimentazione Trasferimento tramite setaccio in imbuto separatore per sedimentazione (30 minuti) Raccolta di 40 ml di liquido Sedimentazione per 10 minuti 10 ml di sedimento + 10 ml di acqua

Metodo di riferimento: agitatore magnetico n FASE 6 : Osservazione microscopica n n Stereomicroscopio 15/20 ingrandimenti Sospetti 60 -100 ingrandimenti (microscopio ottico)

Metodo di riferimento PUNTI DI CONTROLLO CRITICO (CCP) E REQUISITI

Digestione in pool: punti di controllo critico n CCP 1: Identificazione dei campioni n n Numero dei campioni uguale al numero dei suini analizzati Possibilità di risalire ai suini di provenienza

Metodo di riferimento: agitatore magnetico n CCP 1 n n Garantire la tracciabilità fra campione e carcassa o partita di carcasse Predisporre un foglio di lavoro in cui siano riportate le informazioni necessarie n n n n Data Identificazione partite/animali Operatore ha eseguito la prova (firma) Operatore che legge l’analisi (firma) Registrazione lotti reagenti Risultati

Lotto pepsina: Lotto HCl:

Digestione in pool: punti di controllo critico n CCP 2: Qualità del liquido digestivo Giusto rapporto tra liquido digestivo e quantità di tessuto n Misurazioni di pepsina e acido cloridrico n ATTENZIONE: Non miscelare mai direttamente pepsina e acido cloridrico! n

Digestione in pool: punti di controllo critico n CCP 3: Temperatura di digestione (4446°C) n n n Se superiore: inattivazione della pepsina, incompleta digestione Se inferiore: tempi di digestione più lunghi, incompleta digestione Requisito: taratura del termometro

Digestione in pool: punti di controllo critico n CCP 4: Efficacia della digestione n Controllare setaccio n Se il materiale che rimane nel connettivo: campioni non ottimali muscolo indigerito: digestione inefficace

Digestione in pool: punti di controllo critico n CCP 5: Tempo di sedimentazione n Almeno 30 minuti n Utlizzare contaminuti con allarme sonoro

Digestione in pool: punti di controllo critico n CCP 6: Sufficiente chiarificazione n n Possibile lettura di piccoli caratteri a stampa attraverso la Piastra Petri contenente il liquido Ripetere l’ultimo passaggio di sedimentazione aggiungendo acqua di rubinetto

Digestione in pool: punti di controllo critico n CCP 7: Stereomicroscopio n Ingrandimenti sufficienti (15 - 20 meglio fino a 40) n Pulizia n Manutenzione annuale da ditta esterna

Metodo di riferimento REQUISITI STRUTTURALI

Requisiti strutturali n n Sorgenti di energia elettrica Lavabo con collegamento rete idrica Approvvigionamento acqua n Lavaggio vetreria n n Illuminazione idonea Spazio sufficiente Lavastoviglie (utile ma non necessario)

Metodo di riferimento REQUISITI DI PERSONALE

Regolamento (CE) n. 2075/2005 n n n Tutto il personale che partecipa all’esame dei campioni deve essere adeguatamente formato Programma di controllo delle qualità delle analisi Analisi regolare delle procedure di valutazione, registrazione ed analisi

Sicurezza in laboratorio Pericolo Biologico (Trichinella) Rischio quasi trascurabile Dose infettante 100/300 larve vitali Malattia mai dimostrata in seguito a infestazioni in laboratorio Misure precauzionali di base n n n n Camice Guanti Non mangiare, bere, fumare durante esecuzione analisi Non pipettare con la bocca

Sicurezza in laboratorio Pericolo Chimico n n (Acido cloridrico da 37 a 25%) Scheda di sicurezza (è obbligatoria) Misure precauzionali Mantenere il luogo areato le bottiglie o in armadio aspirato n In assenza di cappa chimica, utilizzare DPI per proteggere cute, vie respiratorie e occhi n

Sicurezza in laboratorio

Il Ring Test n n Prova interlaboratorio con cadenza annuale Nel 2007 hanno partecipato complessivamente 31 laboratori I° ciclo Febbraio II ciclo Maggio Esito non conforme al primo ciclo (audit) n Nuove designazioni n

Il Ring Test n Preparazione campioni negativi n n Polpetta da 100 g o 35 g di carne suina magra macinata Preparazione campioni positivi Polpetta come sopra n Frammenti di muscolo di topo infestato fornito da ISS n

Il Ring Test n n Caratteristiche campioni positivi Contengono larve vive (come nella realtà) Contengono un numero di larve pittosto realistico (II ciclo media=35, ds=22) Controllati qualitativamente uno ad uno (impossibile che siano negativi) Numero esatto delle larve non conosciuto a priori (stimato)

Il Ring test n n Precauzioni Larve infestanti (rischio molto basso) Dopo avere analizzato un campione positivo: n n Lavare accuratamente tutte le attrezzature e la vetreria con detergente, spugnetta e scovolino Attenzione le larve tendono ad aderire alla veteria Rischio di contaminazioni crociate Testare un campione negativo per prova

Il Ring Test Precauzioni Trichomatic praticare il programma di lavaggio diverse volte (almeno 4 o 5) aggiungendo, nella camera di digestione, alcuni cc di detersivo per piatti diluito in acqua, pulire attentamente il portafiltro e la reticella di protezione con detergente e spazzola. Al termine di tali lavaggi effettuare una digestione a vuoto (con solo acqua) valutando se nel filtro vi sono ancora larve"