Corso teoricopratico LA GENETICA E LE SUE APPLICAZIONI

Corso teorico-pratico: LA GENETICA E LE SUE APPLICAZIONI IN AMBITO FORENSE 7 -9 settembre 2005 (ore 9 -17) Life Learning Center, via della Beverara 123, Bologna Principi di genetica: il DNA, trasmissione ed analisi molecolare. Dott. ssa Silvia Bonaccorsi, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Roma silvia. bonaccorsi@uniroma 1. it

4 miliardi di anni per generare i meccanismi con cui tutti gli organismi viventi, dai batteri, alle piante all’uomo, devono immagazzinare, replicare, trasmettere alla generazione successiva e utilizzare le informazioni necessarie per lo sviluppo, la crescita, la sopravvivenza nei loro ambienti, cioe’ l’informazione che determina l’identità biologica

Il DNA è la molecola che contiene l’informazione biologica Acido Desossiribo Nucleico contenuto nel nucleo delle cellule Struttura a doppia elica, identificata da Watson e Crick nel 1953

Organizzazione strutturale del DNA Il DNA è una doppia elica costituita da due catene polinucleotidiche avvolte a spirale e antiparallele. 3’ 5’ 5’ 3’ Successione di unità costitutive che si chiamano nucleotidi

Un nucleotide è composto da uno zucchero (il desossiribosio) a cui è legato un gruppo fosfato e una delle 4 basi azotate (Adenina Timina Citosina e Guanina)

Doppio filamento di nucleotidi con coppie di basi complementari La complementarietà delle basi è la proprietà più importante e la chiave per capire come il DNA si replica, trasmette e immagazzina l’informazione genetica

Il DNA è una sequenza di parole scritte con un codice a 4 lettere (le 4 basi) che fornisce l’informazione per “costruire” gli organismi Ogni parola è un Gene A gene Gene B Il DNA è una sequenza di geni (e non solo… molto DNA non codifica niente sembra una sequenza insensata di lettere che puo’ cambiare, ovvero mutare, senza problemi!)

Come si passa dall’ informazione codificata alla forma cellulare? Attraverso la sintesi delle proteine (catene di aminoacidi) Il codice funziona a triplette: una data sequenza di tre basi = un dato aminoacido Ogni gene viene letto dall’apparato cellulare come una sequenza di triplette che permette di sintetizzare una specifica sequenza di aminoacidi cioè una proteina Il trasferimento dell’informazione contenuta nei geni avviene in due passaggi: trascrizione e traduzione

La trascrizione è il processo con cui l’informazione viene trasferita dal DNA all’RNA. La traduzione è il processo con cui l’informazione viene trasferita dall’RNA alle proteine Nucleo Citoplasma ( ( Trascrizione di un’elica Traduzione

Come si duplica il DNA? La struttura stessa del DNA suggerisce come avviene la sua trasmissione da una generazione all’altra. La complementarietà delle basi azotate dirige la sintesi di nuovo DNA indicando la sequenza con cui aggiungere le basi della doppia elica neoformata.

La replicazione del DNA è semiconservativa

Il complemento di DNA di un organismo: genoma Nelle cellule le molecole di DNA che compongono il genoma sono organizzate nei cromosomi.

Dal DNA ai cromosomi 1. I cromosomi: DNA impacchettato con proteine Uomo: 1 metro di DNA Cromosoma umano= 1 -10 m = 10. 000 -200. 000 m di DNA

Dal DNA ai cromosomi 2. Ogni cromosoma porta un insieme particolare di geni. Ogni specie possiede un numero fisso di cromosomi distinguibili per forma e grandezza (cariotipo) In molti organismi (organismi diploidi), ogni cromosoma e i geni che lo compongono sono presenti due volte (cromosomi omologhi)

Il cariotipo umano 22 coppie di cromosomi omologhi e 1 coppia di cromosomi sessuali (XX nelle femmine; XY nei maschi) Totale: 46 cromosomi per cellula

I geni presenti sui cromosomi omologhi possono avere sequenze leggermente diverse e codificare versioni diverse della stessa proteina. Normalmente una delle due versioni è dominante sull’altra e determina la forma visibile (fenotipo). La versione non visibile (recessiva) può manifestarsi nelle generazioni successive

I cromosomi sono visibili al microscopio ottico solo al momento della divisione cellulare perchè si condensano in modo da facilitare la trasmissione del DNA Come vengono trasmessi i cromosomi (e quindi i geni) da una cellula all’altra di un individuo e da una generazione all’altra?

Due tipi di divisione cellulare La mitosi è la divisione che avviene nelle cellule somatiche e nell’uovo fecondato. La meiosi è la divisione che avviene nelle cellule germinali

Mitosi interfase profase metafase anafase telofase Cellule figlie 2 n 2 n replicazione segregazione 2 n La mitosi mantiene costante la quantità di materiale genetico nelle cellule di un organismo

Meiosi n n 2 n n replicazione appaiamento n Segregazione (degli OMOLOGHI) segregazione La meiosi mantiene costante la quantità di materiale genetico attraverso le generazioni e assicura la formazione di nuove combinazioni di cromosomi

I cromosomi (quindi i geni) dei genitori si distribuiscono in modo indipendente nei gameti. Dall’unione di due gameti si forma uno zigote con una combinazione nuova dei genitori. E’ questa combinazione che ne determina l’individualita’ Meiosi Mitosi Meiosi

Riassumendo Il materiale ereditario consiste nel DNA Il DNA è una doppia elica composta da due catene nucleotidiche avvolte l’una sull’altra e orientate in direzioni opposte Le unità funzionali del DNA sono i geni Un gene è un segmento di DNA che codifica una proteina La sequenza nucleotidica del DNA viene trascritta su un RNA e poi tradotta nella sequenza aminoacidica di una proteina Durante la duplicazione del DNA le due catene si separano e funzionano da stampo per la sintesi di due molecole figlie uguali

Riassumendo ancora…. Tutte le cellule di un individuo hanno lo stesso DNA. Ma non sono tutte uguali! Combinazione di geni “on” e “off” = identità cellulare

Analisi del DNA: necessarie sequenze disponibili in gran quantita’ e in forma pura 9 Genoma di mammifero = 3 x 10 bp 1 gene = 3000 bp 1 sequenza su un 1 milione 1. Frammentazione enzimi di restrizione 2. Separazione elettroforesi 3. Identificazione ibridazione con sonda marcata 4. Amplificazione PCR 5. Sequenziamento

Fase 1: digestione del DNA Si utilizzano gli enzimi di restrizione. Sono delle “forbici molecolari” che tagliano (digeriscono) il DNA su entrambi i filamenti in corrispondenza di sequenze specifiche. Si sono evoluti nei batteri come difesa contro DNA estraneo (es. quello virale). DNA Sito di taglio A B Numero e lunghezza dei frammenti dipendono dalla frequenza della sequenza sul DNA (sequenze più corte: statisticamente più frequenti). C D

Fase 2: separazione del DNA I frammenti di DNA vengono separati in base alla loro lunghezza attraverso un campo elettrico (elettrofresi). Successione di bande Frammento più lungo Frammento più corto A D B C

Fase 3: Identificazione del DNA Una sequenza di DNA può fungere da sonda per identificare segmenti di DNA che hanno sequenza nucleotidica identica o molto simile in base al principio della complementarità delle basi. Le sonde: frammenti purificati a singolo filamento che vengono “marcati” (isotopi radioattivi o composti fluorescenti) in modo da poter funzionare come traccianti

Fase 3: Identificazione del DNA denaturati (singola elica) separati per elettroforesi e trasferiti su una membrana porosa poi immersa nella soluzione con la sonda marcata (tracciante) “Southern blotting” Il filamento singolo della sonda riconosce la sequenza complementare sul DNA e vi si lega.

Amplificazione PCR Reazione a Catena della Polimerasi Metodo per amplificare rapidamente un singolo frammento di DNA da una miscela complessa Cicli ripetuti di: 1. Denaturazione al calore 2. Primers (oligonucleotidi) 3. Polimerizzazione con polimerasi Taq (resistente al calore)

Testi consigliati (per ricordare e approfondire!) • D. P. Snustad e M. J. Simmons: Pricipi di Genetica • (Zanichelli editore) • Capitoli 1 -7, 10 -14, 20 -22 • L. H. Hartwell, L. Hood, M. L. Goldberg, A. E. Reynolds, L. M. Silver, R. H. Veres: Genetica dall’analisi formale alla genomica • (Mc. Graw-Hill editore) • Capitoli 1 -4, 6 -9, 10 -13