Srec metody Sren u u u Nezamovat s

Srážecí metody

Srážení u u u Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu První metody používané pro separaci bílkovin – Et. OH, (NH 4)2 SO 4 Filtrace nahrazena centrifugací

Rozpustnost bílkoviny u Vlastnostmi bílkoviny – distribuce hydrofobních a hydrofilních skupin na povrchu bílkoviny + + + -

Rozpustnost bílkoviny u Vlastnostmi roztoku – p. H, iontová síla, org. rozpouštědla, org. polymery, teplota

Izoelektrická precipitace + + + - p. I + - - -

Srážení neutrálními solemi vsolování vysolování

Vsolování H 2 O - + - H 2 O + H 2 O - - + H 2 O + + H 2 O

Vsolování

Vysolování

Vysolování

Praktické aspekty u Hofmeistrova řada Anionty SCN-, J-, Cl. O 4 -, NO 3 -, Br-, Cl-, Ac-, SO 42 -, PO 43 - Kationty Na+, K+, NH 4+

(NH 4)2 SO 4 Rozpustnost se málo mění s teplotou u Saturovaný roztok 4 M - hustota 1, 235 g/cm 3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1, 29 g/cm 3) u Levný u Stabilizuje bílkoviny u Relativně čistý u

Srážecí křivka (NH 4)2 SO 4 0 10 20 30 Koncentrace bílkoviny 40 50 60 70 80 90 100 % Aktivita bílkoviny

Srážení - dvojstupňově

Srážení - dvojstupňově

Přidané množství u Tabulky u Vzorce

Přidané množství u Tabulky u Vzorce

Provedení Chlazení Míchání 10 -30’ Centrifugace pevný (NH 4)2 SO 4 nebo saturovaný roztok (NH 4)2 SO 4 úprava p. H NH 4 OH El. míchačka

Srážení org. rozpouštědly mísitelnými s vodou u Rozpouštědla ruší solvatační obal bílkoviny H 2 O - + - H 2 O + H 2 O - - + H 2 O + + H 2 O

Srážení org. rozpouštědly mísitelnými s vodou

Výběr rozpouštědla u Kompletně mísitelné s vodou u Nereaguje s bílkovinou u Musí mít dobrý precipitační efekt Et. OH, aceton, Met. OH, propanol, dioxan

Srážení org. rozpouštědly mísitelnými s vodou u Nutno provádět při T < 0 o. C, při větší teplotě dochází k denaturaci u Dvojstupňově u Přídavky z tabulky nebo podle vzorce

Srážení org. polymery Princip identický s rozpouštědly DEAE dextran u PEG u Polyakrylová kyselina u Rivanol u Kaprylová kyselina u

Srážení selektivní denaturací u u u Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina musí zůstat z 85 - 90 % v nativním stavu. Denaturační vlivy – T, p. H, org. rozpouštědla Bílkovina musí nejen denaturovat i precipitovat

Tepelná denaturace

Tepelná denaturace u u Doba inkubace je důležitá pouze pro reprodukovatelnost – denaturační křivka se tím posouvá po teplotní ose, má význam pro vyhřívání větších objemů Přídavky některých látek (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových bílkovin

u u p. H při tepelné denaturaci musí být přesně definováno Při vyšší teplotě běží více proteolýza

p. H denaturace u Provádět za definované teploty u Změny p. H dělat co nejrychleji u Pro změny pokud možno nepoužívat silné kyseliny a zásady

p. H u 5 4 2 HAc k. mléčná H 3 PO 4, H 2 SO 4 p. H 8 Tris 9 DEA 11 Na. OH Extrémy p. H – bílkovina silně ionizovaná a zůstává v rozpuštěném stavu nutná zpětná úprava p. H

Denaturace org. rozpouštědly u u Pří srážení organickými rozpouštědly – T < 0 o. C Pří denaturaci organickými rozpouštědly – T = 20 – 30 o. C Alkoholy s delšími alifatickými řetězci mají větší denaturační vliv T a p. H musí být přesně definovány Et. OH, Met. OH, aceton