CHROMATOGRAFIA cz I Metody rozdzielcze Parametry chromatograficzne Podstawowe

CHROMATOGRAFIA cz. I Metody rozdzielcze Parametry chromatograficzne Podstawowe mechanizmy retencji Klasyfikacja metod chromatograficznych Walidacja metod chromatograficznych

Metody rozdzielcze Rozdzielenie (ang. separation): • proces, w którym mieszanina jest podzielona przynajmniej na dwie frakcje o zróżnicowanym składzie; • uzyskiwane poprzez wykorzystanie metod fizycznych, jak również reakcji chemicznych; • przeprowadzone w różny sposób; • dotyczy bardzo zróżnicowanych mieszanin; • prowadzone w różnym celu (analityczny, preparatywny); • prowadzone w różnej skali (laboratoryjnej, przemysłowej).

Techniki separacyjne Kryteriami klasyfikacji metod rozdzielczych: • cel, • rodzaj mieszaniny, • fizyczne i chemiczne zjawiska wykorzystywane w rozdzieleniu.

Techniki separacyjne Podstawowe grupy mechanizmów wykorzystywanych w separacji analitycznej: podział, adsorpcja oraz filtracja. Filtracja - charakter wyłącznie fizyczny, zastosowanie głównie w procesach zatężania i wydzielania analitów z matryc. Sorpcja i podział oparte na oddziaływaniach fizykochemicznych pomiędzy analitem a medium separacyjnym.

Techniki separacyjne Początki technik separacyjnych: • odkrycie zjawiska chromatografii przez Michaiła Cwieta • Irving Langmuir (Nagroda Nobla w 1932) oraz Archer Martin i Richard Synge (Nagroda Nobla w 1952) - badania nad fizykochemią powierzchni oraz zjawiskami międzyfazowego podziału.

Techniki separacyjne w chemii analitycznej • Techniki ekstrakcyjne: Ekstrakcja gazem Ekstrakcja cieczą Ekstrakcja do fazy stałej • Techniki chromatograficzne: Chromatografia gazowa (Chromatografia kolumnowa) Chromatografia cieczą w stanie nadkrytycznym (Chromatografia kolumnowa) Chromatografia cieczowa (Chromatografia kolumnowa, planarna) • Techniki elektromigracyjne: Elektroforeza żelowa na płaszczyźnie Elektroforeza kapilarna

Techniki separacyjne - ekstrakcja Ekstrakcja próbek ciekłych • Ekstrakcja ciecz-gaz, np. statyczna/dynamiczna analiza fazy nadpowierzchniowej wymywanie i wychwytywanie • Ekstrakcja ciecz-ciecz, np. klasyczna ciecz-ciecz ekstrakcja ciągła mikroekstrakcja • Ekstrakcja ciecz-ciało stałe, np. ekstrakcja/mikroekstrakcja do fazy stałej mikroekstrakcja poprzez membranę do fazy stacjonarnej ekstrakcja do fazy stałej w strzykawce

Techniki separacyjne - ekstrakcja Ekstrakcja próbek stałych • Ekstrakcja ciało stałe-gaz, np. ekstrakcja do fazy stałej w układzie statycznym ekstrakcja do fazy stałej w układzie dynamicznym • Ekstrakcja ciało stałe-ciecz, np. rozpuszczalnikiem przez wytrząsanie w aparacie Soxhleta ekstrakcja rozpuszczalnikiem pod zwiększonym ciśnieniem ekstrakcja rozpuszczalnikiem wspomagana promieniowaniem mikrofalowym

Techniki separacyjne - ekstrakcja Ekstrakcja próbek gazowych • Ekstrakcja gaz-ciecz, np. Ekstrakcja do fazy ciekłej Ekstrakcja przez błony półprzepuszczalne • Ekstrakcja gaz-ciało stałe , np. Ekstrakcja do fazy stacjonarnej Mikroekstrakcja do fazy stałej Ekstrakcja przez membrany porowate

Elektroforeza Elektroliza – proces zachodzący przy powierzchni elektrod i polega na odkładaniu się substancji, pochodzących z elektrolitu, na elektrodach pod wpływem przepływającego prądu. Procesy te opisywane są ilościowo prawami elektrolizy Faraday’a. Elektroforeza - procesy elektrokinetyczne zachodzące w objętości elektrolitu i polegające na przemieszczaniu się jonów i makrojonów w polu elektrycznym.

Elektroforeza • Polega na rozdziale mieszaniny makrocząsteczek pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego. • Cząsteczki wędrują w żelu w zależności od ich ładunku, rozmiaru, kształtu oraz oporów ruchu środowiska (gęstości żelu). • Elektroforezę najczęściej prowadzi się na żelach poliakrylamidowych. • Jest stosowana do rozdziału biopolimerów (np. białek, kwasów nukleinowych) i innych związków biologicznie czynnych (m. in. aminokwasów), a także związków jonowych.

Elektroforeza Głównym obszarem zastosowań elektroforezy są: - biochemia białek i kwasów nukleinowych, - biologia molekularna, farmakologia, medycyna sądowa, weterynaria, diagnostyka medyczna oraz kontrola jakości żywności.

Elektroforeza Rozdziały elektroforetyczne mogą być prowadzone: - bezpośrednio w objętości elektrolitu, np. elektroforeza kapilarna, - w nośniku elektroforetycznym wypełnionym odpowiednim elektrolitem. Nośnik elektroforetyczny (bibuła, azotan celulozy, agaroza, poliakrylamid i inne) nie tylko stabilizuje elektrolit ale często przyczynia się do lepszej separacji makrocząsteczek.

Elektroforeza Ze względu na sposób umieszczenia nośnika elektroforetycznego można wyróżnić: - elektroforezę kapilarną (ang. capillary electrophoresis), - elektroforezę pionową (ang. vertical electrophoresis), - elektroforezę poziomą (ang. horizontal electrophoresis).

Elektroforeza • Przeznaczeniem elektroforezy kapilarnej są rozdziały analityczne i mikropreparatywne. • Ilość nanoszonego materiału do analizy jest bardzo niewielka - rzędu pojedynczych nanogramów. • Objętość aplikowanej próbki waha się zwykle w przedziale 2 -4 nl (2 -4 x 10 -9 l). • Czas rozdziału jednej próbki wynosi około 10 -20 minut. • Detekcja rozdzielonych grup makrocząsteczek realizowana jest u ujścia kapilary przy pomocy detektora o konstrukcji zbliżonej do przepływowego detektora stosowanego w chromatografii cieczowej.

Elektroforeza pionowa - nośnik elektroforetyczny wypełnia szklane rurki (elektroforeza rurkowa) lub znajduje się pomiędzy dwoma płytkami rozdzielonymi przekładkami dystansowymi (ang. spacer) (elektroforeza płytowa). Elektroforeza pozioma - nośnik umieszczony jest w płaszczyźnie poziomej. Elektroforeza półsucha - bufory elektrodowe zamknięte są w zestalonej agarozie lub w warstwach bibuły filtracyjnej.

Pierwszy chromatograficzny rozdział Profesor Michaił Cwiet, 23 kwietnia 1905 r. , Warszawa - kolumna szklana wypełniona sproszkowanym węglanem wapnia (kredą), - chloroformowy roztwór barwników organicznych, nanoszony na wierzchołek kolumny, w miarę przechodzenia przez warstwę kredy ulegał rozdziałowi i poszczególne składniki były widoczne w postaci barwnych stref, - po wyjęciu słupka kredy z kolumny można było go podzielić i wyodrębnić poszczególne składniki, - zamiast kredy zaczęto stosować inne, bardziej efektywne wypełnienia kolumn (adsorbenty), dające lepsze rozdziały.

Rozwój chromatografii - Lata 30 -te – właściwy rozwój chromatografii, rozdzielanie mieszanin substancji naturalnych; - 1941 r. – prace A. J. Martina i R. L. Synge’a, początek rozwoju chromatografii podziałowej w układzie ciecz-ciecz (chromatografia bibułowa) – Nagroda Nobla; - 1952 r. – A. T. James i A. J. Martin, podstawy chromatografii gazowej; - 1956 r. – E. Stahl – podał warunki wykonywania chromatografii cienkowarstwowej; - Lata 60 -te – rozwój wysokosprawnej chromatografii cieczowej.

Chromatografia (gr. chromatos = barwa + grapho = pisze) • Podstawowa technika analityczna lub preparatywna służąca do rozdzielania i identyfikacji związków chemicznych w mieszaninie. • Składniki mieszaniny: - są rozdzielane na podstawie różnicy szybkości, z jaką są przenoszone w gazowej lub ciekłej fazie ruchomej przez fazę stacjonarną; - migrują przez fazę stacjonarną z szybkościami określonymi przez ich powinowactwo do każdej fazy. • Każdą substancję charakteryzują określone parametry retencji (zatrzymania).

Chromatografia Układ chromatograficzny składa się z: - fazy nieruchomej - fazy ruchomej - mieszaniny rozdzielanych substancji

Chromatografia Rozdzielenie chromatograficzne polega na: - umieszczeniu próbki na ciekłej lub stałej fazie stacjonarnej, - przepuszczeniu ciekłej lub gazowej fazy ruchomej przez nią lub nad nią - elucja próbki z fazy stacjonarnej.

Techniki chromatograficzne - planarne i kolumnowe, w zależności od tego, czy proces rozdzielania zachodzi na płaskiej powierzchni czy kolumnie; - cieczowe, gazowe i z fazą ruchomą w stanie nadkrytycznym, w zależności od stanu skupienia fazy ruchomej.

Chromatografia planarna - bibułowa (Paper Chromatography, PC) - cienkowarstwowa (Thin Layer Chromatography, TLC) - wysokosprawna cienkowarstwowa (High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC)

Chromatografia kolumnowa - kolumnowa grawitacyjna (Liquid Chromatography, LC) - kolumnowa wysokosprawna (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) - gazowa (Gas Chromatography, GC)

W zależności od celu przeprowadzanej analizy techniki eksperymentalne dzielimy na: - analityczne - identyfikacja analitów, „mała” ilość próbki - preparatywne - wyodrębnianie poszczególnych składników z mieszaniny

Faza stacjonarna (nieruchoma) Faza stacjonarna jest unieruchomiona w odpowiednim miejscu wewnątrz kolumny lub na płaskiej powierzchni. Faza stacjonarna ma charakter i spełnia rolę sorbentu – na zasadzie zatrzymywania substancji rozdzielanej na powierzchni (adsorpcja) lub w masie (absorpcja). Fazę stacjonarną stanowić: • Porowate ciała stałe o dużej powierzchni adsorpcji; • Ciecze trudno lotne; • Substancje o charakterze żelowym.

Nośnik Faza stacjonarna o zdolnościach sorpcyjnych, rozmieszczona jest na powierzchni nośnika. W chromatografii cienkowarstwowej nośnikiem są: • płyty szklane; • płyty aluminiowe; • płyty plastikowe. W chromatografii bibułowej: • paski bibuły. W chromatografii gazowej: • powierzchnia wewnętrzna kolumny. W chromatografii kolumnowej : • nośnik nie występuje lub jest nim pozbawione zdolności sorpcyjnych wypełnienie drobnoziarniste.

Faza ruchoma (eluent) Faza ruchoma przemieszcza się nad lub przez fazę stacjonarną wraz z mieszaniną analitów przenosząc składniki z różną prędkością w ustalonym kierunku. Faza ruchoma może być: • Cieczą – w chromatografii cieczowej (LC – liquid chromatography) – występuje najczęściej, zarówno w technikach planarnych jak i kolumnowych. • Gazem – w chromatografii gazowej (GC – gas chromatography) • Płynem w stanie nadkrytycznym – w chromatografii fluidalnej (SFC – supercritical fluid chromatography).

Faza ruchoma (eluent) • Fazy ruchome w chromatografii cieczowej rzadko stanowią pojedyncze rozpuszczalniki lecz dwu- lub więcej składnikowe mieszaniny. • Faza ruchoma, którą wprowadza się do kolumny, nosi nazwę eluentu. • W kolumnie w skład fazy ruchomej oprócz eluentu mogą wchodzić także składniki rozdzielanej mieszaniny. • Po rozdzieleniu składniki te są obecne w wycieku z kolumny, który nosi nazwę eluatu. • Rodzaj i ilość rozpuszczalników stanowiących fazę ruchomą ma istotny wpływ na proces chromatografowania. • Przy wyborze fazy ruchomej należy uwzględnić rodzaj i skład rozdzielanej mieszaniny, rodzaj zastosowanego wypełnienia kolumny oraz rodzaj detektora.

Faza ruchoma (eluent) • W celu ułatwienia wyboru właściwego rozpuszczalnika jako eluentu, rozpuszczalniki ułożono w szeregi eluotropowe. • W przypadku polarnych faz stacjonarnych (np. żelu krzemionkowego lub tlenku glinu) rozpuszczalniki ułożone wg rosnącej mocy eluowania (miarą której są indeksy polarności) mają kolejność następującą: n-pentan < n-heksan < cykloheksan < tetrachlorek węgla < toluen < benzen < eter dietylowy < chloroform < dichlorometan <tetrahydrofuran < dichloroetan < aceton < octan etylu < acetonitryl < pirydyna < etanol < metanol <woda < kwas octowy. • Moc elucji przy chromatografowaniu na niepolarnej fazie stacjonarnej (np. węglowej fazie odwróconej) jest odwrotna.

Faza ruchoma (eluent) • Inne ważne cechy eluentów: - lepkość - wpływa ona na wysokość ciśnienia potrzebnego do wywołania odpowiedniego przepływu rozpuszczalnika przez kolumnę (należy stosować eluenty o małej lepkości). - współczynnik załamania światła - w przypadku zastosowania detektora refraktometrycznego - granicę długości fali promieniowania elektromagnetycznego - przy której rozpuszczalnik staje się nieprzezroczysty dla nadfioletu (w przypadku stosowania absorpcyjnego detektora UV).

Faza ruchoma i faza stacjonarna znacznie różnią się pomiędzy sobą pod względem właściwości fizykochemicznych.

Parametry chromatograficzne • Retencja (łac. retentio – powstrzymywanie) - w chromatografii charakteryzuje czas przebywania substancji w kolumnie chromatograficznej - składniki próbki mogą wędrować przez kolumnę chromatograficzną wolniej niż faza ruchoma. • Na chromatogramie można określić parametry retencyjne rozdzielanej substancji - opisują one zachowanie się rozdzielanych składników mieszaniny.

Parametry chromatograficzne Podstawowym parametrem określającym podział substancji między obie fazy jest współczynnik retencji k. k= zawartość substancji w fazie nieruchomej zawartość substancji w fazie ruchomej Współczynnik retencji zależy od struktury molekularnej substancji chromatografowanej. Związany jest on ze wszystkimi rodzajami chromatografii.

Proces rozdziału analitu pomiędzy dwie fazy – wyznaczenie współczynnika retencji (k) Substancja wykazuje duży stopień powinowactwa do rozpuszczalnika – porusza się szybko, Substancja wykazuje duży stopień powinowactwa do fazy stacjonarnej – porusza się wolno.

Parametry chromatograficzne – chromatografia planarna Współczynnik migracji Rf określa ułamek czasu spędzonego przez substancję w fazie ruchomej – stosowany w chromatografii planarnej. Rf = A/B Rf = 1/(1+k) RM = log k = log (1/Rf – 1) Inne nazwy stosowane dla współczynnika migracji to: faktor retencji; ułamek prędkości; współczynnik zatrzymania lub spowolnienia; rate fraction.

Parametry chromatograficzne – chromatografia planarna 0, 0 < Rf < 1, 0 Wartość Rf - równa lub bliska zeru - substancja adsorbuje się bardzo silnie i niewiele czasu spędza w fazie ruchomej. Wartość Rf > 0, 8 - substancja adsorbuje się bardzo słabo i dużo czasu spędza w fazie ruchomej.

Parametry chromatograficzne – chromatografia kolumnowa Chromatogram stanowi graficzną reprezentację sygnału chromatograficznego. Chromatogram przedstawia wykres wskazań sygnału uzyskanego w detektorze (odpowiadającego zmianom stężenia substancji w fazie ruchomej opuszczającej kolumnę i przechodzącej przez detektor) w funkcji czasu lub (rzadko) w funkcji objętości fazy ruchomej.

Parametry chromatograficzne – chromatografia kolumnowa Chromatogram dostarcza informacji: • o składzie jakościowym rozdzielanej próbki (położenie piku substancji na chromatogramie, czyli czas retencji piku, pozwala na jej identyfikację), • o składzie ilościowym rozdzielanej próbki (wysokość i pole powierzchni piku substancji odpowiada jej stężeniu w próbce).

Parametry chromatograficzne – chromatografia kolumnowa Najczęściej stosowane w chromatografii parametry retencyjne to: • czas retencji substancji niezatrzymywanej t. M (czas martwy; zerowy) • całkowity czas retencji t. R • zredukowany czas retencji t’R – różnica pomiędzy całkowitym czasem retencji badanej substancji i czasem retencji substancji niezatrzymywanej: t'R = t. R − t. M

Parametry chromatograficzne – chromatografia kolumnowa • objętość retencji substancji niezatrzymywanej VM (objętość martwa, zerowa) VM = t. M Fc Fc - natężenie przepływu fazy ruchomej (objętościowa prędkość przepływu fazy ruchomej) w temperaturze kolumny. • całkowita objętość retencji VR VR = t. R Fc • zredukowana objętość retencji V’R V'R =VR - VM

Parametry chromatograficzne – chromatografia kolumnowa Współczynnik rozdzielenia – α "współczynnik selektywności„ "retencja względna„ • jest miarą selektywności układu rozdzielczego (chromatograficznego), • charakteryzuje wzajemne oddziaływania substancji rozdzielanych z fazą ruchomą i fazą stacjonarną, • zależy od chemicznej budowy składników rozdzielanej mieszaniny, a także od rodzaju i właściwości obu faz, • można go opisać jako odległość pomiędzy maksimum (najczęściej sąsiednich) pików chromatograficznych.

Parametry chromatograficzne – chromatografia kolumnowa Selektywność - Współczynnik rozdzielania (α) Współczynnik rozdzielania jest miarą czasu lub odległości między maksymalnymi wartościami dwóch pików. α= k 2 / k 1 - współczynnik retencji pierwszego piku k 2 - współczynnik retencji drugiego piku t. R 1 – czas retencji pierwszego piku t. R 2 – czas retencji drugiego piku Jeżeli α = 1, piki mają tę samą retencję i koeluują. α=t. R 2 / t. R 1

Parametry chromatograficzne – chromatografia kolumnowa Teoretyczna liczba półek (N) lub sprawność kolumny • objętość kolumny, w której zostaje osiągnięty stan (dynamicznej) równowagi pomiędzy stężeniem związku w fazie stacjonarnej, a jego stężeniem w fazie ruchomej; • opisuje proces zachodzący w kolumnie chromatograficznej w sposób bardzo uproszczony; • termin został zaczerpnięty z teorii destylacji i ma wymiar całkowicie teoretyczny.

Parametry chromatograficzne – chromatografia kolumnowa Teoretyczna liczba półek (N) lub sprawność kolumny Sprawność kolumny wyrażona jest liczbą półek teoretycznych (N) (zdolność kolumny do wytwarzania wąskich pików). Liczba teoretycznych półek jest pośrednią miarą szerokości piku dla piku o specyficznym czasie retencji. N = 5. 545[t. R / wh]2 N = 16[t. R / wb]2 N = liczba półek teoretycznych t. R = czas retencji, całkowity czas jaki substancja spędza w kolumnie wh = szerokość piku w połowie wysokości (w jednostkach czasu) wb= szerokość piku w podstawie (w jednostkach czasu)

Parametry chromatograficzne – chromatografia kolumnowa Liczba półek efektywnych Nef

Parametry chromatograficzne – chromatografia kolumnowa Sprawność kolumn chromatograficznych: • decyduje o tym, czy uzyskane piki są wąskie czy szerokie; • zależy od liczby półek teoretycznych (N) w danej kolumnie. Im więcej półek teoretycznych, tym kolumna jest sprawniejsza i uzyskane piki rozdzielanych substancji są węższe. Liczba półek teoretycznych zależy od długości kolumny L oraz od wysokości pojedynczej półki H: N = L/H N – liczba półek teoretycznych, L – długość kolumny, H – wysokość równoważna półce teoretycznej, inaczej oznaczana WRPT.

Parametry chromatograficzne – chromatografia kolumnowa Powiązanie sprawności i selektywności - Rozdzielczość pików Rs t. R 1 - czas retencji pierwszego piku t. R 2 - czas retencji drugiego piku wb 1 - szerokość piku przy podstawie (w jednostkach czasu) – pik pierwszy wb 2 - szerokość piku przy podstawie (w jednostkach czasu) – pik drugi Pełne rozdzielenie występuje przy Rs = 1, 5.

Parametry chromatograficzne – chromatografia kolumnowa Zdolność rozdzielcza pików - wzór Purnella: Na rozdzielczość pików Rs wpływają trzy parametry: sprawność, N - liczba półek teoretycznych – wpływa na szerokość pików selektywność – wpływa na oddalenie pików retencja – wyrażona ułamkiem zawartości substancji w fazie nieruchomej Ponieważ , można zapisać

Podstawowe mechanizmy retencji Warunkiem uzyskania rozdziału jest zróżnicowanie warunków środowiska fazy stacjonarnej i fazy ruchomej. Różnica powinowactwa substancji rozdzielanej do tych faz lub możliwość tworzenia oddziaływań fizykochemicznych substancji z fazą stacjonarną powoduje możliwość uzyskania efektu retencji. Mechanizm retencji Mechanizm sorpcji podziałowy podział adsorpcyjny adsorpcja jonowymienny wymiana jonowa żelowo-permeacyjny wykluczenie

Podstawowe mechanizmy retencji Sorpcja jest procesem, podczas którego cząstki substancji przemieszczają się z fazy ruchomej do fazy stacjonarnej. Desorpcja jest procesem odwrotnym. Procesy te zachodzą w sposób ciągły podczas rozdzielania chromatograficznego. Układ znajduje się w stanie równowagi dynamicznej. W czasie przesuwania się fazy ruchomej substancja ulega wielokrotnie podziałowi między obie fazy.

Podziałowy mechanizm retencji Podział jest procesem podobnym do ekstrakcji rozpuszczalnikowej. Faza ciekła pokrywa nośnik lub podłoże pierwotne (drobnoziarniste) w postaci naniesionej lub związanej chemicznie. Gdy ciecz jest związana występuje mechanizm zmodyfikowanego podziału. Substancje rozdzielane dzielą się zgodnie z ich rozpuszczalnością (powinowactwem) w fazie stacjonarnej i ruchomej. Rozdzielane substancje są rozpuszczane w fazie stacjonarnej i fazie ruchomej. Im większa rozpuszczalność w ciekłej fazie stacjonarnej tym większy czas retencji. Fazą stacjonarną w mechanizmie podziałowym jest ciecz trudno lotna, żel lub inna substancja pęczniejąca. Czysty mechanizm podziałowy występuje w chromatografii gaz-ciecz.

Chromatografia podziałowa - podział każdej substancji pomiędzy dwie fazy opisuje ilościowo tzw. współczynnik podziału (D) D= - w wyniku Cs (stężenie substancji w fazie nieruchomej) Cm (stężenie substancji w fazie ruchomej) różnic we współczynnikach podziału składników próbki i wynikających z nich zróżnicowanych prędkości migracji następuje rozdział mieszaniny.

Chromatografia podziałowa - Chromatografia cieczowo-gazowa (gazowa, GC) - Chromatografia cieczowo-cieczowa (np. bibułowa, PC) Techniki: kolumnowa grawitacyjna, planarna, GC, HPLC

Chromatografia podziałowa Chromatografia cieczowo-cieczowa układ z normalnymi fazami (NP – Normal Phase) • faza ruchoma – ciecz organiczna (np. heksan, benzen lub chloroform); • faza stacjonarna – ciecz polarna osadzona na nośniku stałym (np. woda na celulozie); • metoda stosowana do rozdziału m. in. barwników, pestycydów, alkaloidów, glikoli, fenoli.

Chromatografia podziałowa Chromatografia cieczowo-cieczowa układ z odwróconymi fazami (RP- Reverse Phase) • faza ruchoma – ciecz polarna (np. woda, metanol); • faza stacjonarna – rozpuszczalnik organiczny zaadsorbowany na nośniku; • metoda stosowana w rozdziale takich związków jak, np. antrachinony, antybiotyki, barbiturany, witaminy.

Nośnik Powinien: • być obojętny wobec rozpuszczalników i rozdzielanych substancji, • nie wykazywać własności adsorpcyjnych i jonowymiennych, • być zwilżany fazą ruchomą, • składać się z jednorodnych ziaren o odpowiedniej wielkości (im mniejsze, tym lepszy rozdział, ale tym wolniejszy przepływ rozpuszczalnika).

Adsorpcyjny mechanizm retencji Chromatografia ciecz - ciało stałe W chromatografii tego rodzaju rozdział następuje pomiędzy ciekłą fazę ruchomą a fazę stacjonarną, na której odwracalnie adsorbują się cząsteczki rozdzielanych substancji. Chromatografia w normalnym układzie faz (NP – Normal Phase) - z polarnymi fazami stacjonarnymi (żel krzemionkowy, tlenek glinu) stosuje się mało polarne fazy ruchome (np. heksan, chloroform). Chromatografia w odwróconym układzie faz (RP- Reverse Phase) - w przypadku niepolarnych faz stacjonarnych (np. polimery) stosuje się polarne fazy ruchome (np. woda, metanol).

Adsorpcyjny mechanizm retencji Adsorpcja jest efektem powierzchniowym. W normalnym układzie faz (NP) wynika z oddziaływań elektrostatycznych (wiązania wodorowe, oddz. dipol-dipol, dipol-dipol indukowany) pomiędzy substancją i miejscami polarnymi (polarne grupy funkcyjne np. OH, Si-O-Si lub Si-OH) fazy stacjonarnej. Faza stacjonarna jest polarna. W odwróconym układzie faz (RP) włókna łańcuchów węglowodorowych pokrywające fazę stacjonarną (długość łańcuchów węglowodorowych od C 2 do C 18) zatrzymują mechanicznie cząstki substancji (oddziaływania hydrofobowe).

Adsorbent Powinien: • mieć jak najsilniej rozwiniętą powierzchnię, • składać się z odpowiedniej wielkości ziaren o jednorodnej wielkości, • być bierny chemicznie wobec rozpuszczalnika i substancji rozdzielanych, • być selektywny.

Szereg aktywności adsorbentów pod względem wiązania związków organicznych: celuloza < skrobia < sacharoza < Ca. SO 4 < silikażel < Mg. O < Al 2 O 3 < węgiel aktywny Szereg eluotropowy rozpuszczalników Obejmuje powszechnie używane w chromatografii adsorpcyjnej rozpuszczalniki zgodnie za zmianą ich zdolności adsorpcyjnej i efektywności wymywania związków zaadsorbowanych: heksan < CCl 4 < benzen < CHCl 3 < (C 2 H 5)2 O < CH 3 COOC 2 H 5 < aceton < C 2 H 5 OH < CH 3 OH < H 2 O < CH 3 COOH < pirydyna

Jonowymienny mechanizm retencji Wymiana jonowa jest procesem, w którym jony substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej mogą ulegać wymianie na mobilne przeciwjony obdarzone takim samym ładunkiem i związane z przeciwnie naładowanymi, nieruchomymi grupami, chemicznie związanymi z fazą stacjonarną. Faza stacjonarna jest polimerowym przepuszczalnym ciałem stałym (nierozpuszczalna żywica, chemicznie zmodyfikowana krzemionka).

Żelowo-permeacyjny mechanizm retencji Wykluczenie jest procesem, w którym cząstki substancji rozdzielanej o rozmiarach większych od średnicy największych porów fazy stacjonarnej pozostają wyłącznie w fazie ruchomej (k=0). Cząstki substancji o rozmiarach mniejszych od średnicy najmniejszych porów dyfundują wszędzie w obrębie struktury fazy stacjonarnej i migrują najwolniej. Fazę stacjonarną stanowią: polisacharydy – żele pęczniejące w wodzie lub polimery niepolarne. Efekt rozdzielenia zależy od wielkości cząstek substancji.

Walidacja metod chromatograficznych Walidacja metody (ang. method validation) jest to proces oceny metody analitycznej, którego celem jest zapewnienie zgodności ze stawianymi tej metodzie wymogami, definiujący tę metodę, a także pozwalający określić jej przydatność. Ma na celu zapewnienie, czy proces analizy przebiega w sposób rzetelny i precyzyjny oraz czy daje miarodajne wyniki. Do badań walidacyjnych przystępuje się zazwyczaj wtedy, gdy: - opracowuje się nową metodę analityczną, - wprowadza się w niej zmiany, - parametry metody ulegają zmianom pod wpływem czasu - ustaloną metodę wykorzystuje się w innym laboratorium albo przez innych analityków bądź za pomocą innych przyrządów.

Walidacja metod chromatograficznych Przed przystąpieniem do procesu walidacji, należy: - określić przeznaczenie metody analitycznej, - jej zakres, - cechy charakterystyczne, tj. rodzaj oznaczanego składnika, poziom stężenia, rodzaj matrycy, obecność interferentów, - zdefiniować testowane parametry analityczne, - sprecyzować charakterystykę sprzętu oraz przedstawić przebieg eksperymentu walidacyjnego.

Walidacja metod chromatograficznych Sam proces walidacji może być przeprowadzony w dowolnej kolejności i nie zawsze istnieje konieczność przeprowadzenia pełnego procesu. Metoda może zostać poddana walidacji jedynie wówczas, gdy wcześniej zostały przeprowadzone odpowiednie badania optymalizacyjne. Wybór parametrów charakteryzujących daną metodę analityczną zależy od szeregu czynników. Należy wziąć pod uwagę: - charakter badań, - stawiane im wymogi, - czasochłonność, - koszty związane z procesem walidacji.

Walidacja metod chromatograficznych Istnieje pewne zestawienie parametrów zgodnych z rekomendacją International Conference on Harmonisation (ICH) oraz z zaleceniami The United States Pharmacopea (USP), będących podstawą procesu walidacji. Są to: - specyficzność i selektywność - dokładność - precyzja (powtarzalność, odtwarzalność = precyzja pośrednia) - liniowość - zakres - granice wykrywalności i oznaczalności - trwałość - robustness (odporność metody) - ruggednes (odtwarzalność metody).

Walidacja metod chromatograficznych W przypadku metod chromatograficznych należy w szczególności ustosunkować się do następujących zagadnień: • Czystość rozpuszczalników, służących do przygotowywania próbek, roztworów wzorcowych oraz ewentualnie (nie dotyczy to oczywiście chromatografii gazowej) fazy ruchomej – czy wystarczą rozpuszczalniki cz. d. a. (czyste do analizy), czy muszą być czystości HPLC?

Walidacja metod chromatograficznych • Jakość odczynników, używanych np. do reakcji barwnych w procesie wywoływania chromatogramów cienkowarstwowych lub derywatyzacji substancji przed wykonaniem oznaczenia za pomocą chromatografii gazowej. • Jakość płytek chromatograficznych – zwykłe czy tzw. wysokosprawne (o mniejszej i bardziej wyrównanej średnicy ziaren fazy stacjonarnej). • Temperatura, wilgotność i ciśnienie atmosferyczne w laboratorium – mogą wpłynąć na współczynniki retencji.

Ocena statystyczna wyników Ma na celu uwodnienie, że wyniki analizy uzyskane w trakcie prawidłowo zaplanowanych badań mają wartość rzeczywistą. Istotnymi elementami oceny statystycznej wyników są: - eliminacja wyników wątpliwych, - charakterystyka wielkości przypadkowych, - porównanie statystyczne metod i wyników, - analiza regresji.

Ocena statystyczna wyników Jedną z metod wykrywania wyników wątpliwych, w próbkach nie przekraczających zwykle 10 wyników, jest metoda zwana testem Q-Dixona. xw – wynik wątpliwy xn – wynik najbliższy co do wielkości w uporządkowanym szeregu wyników o coraz większej wartości, R – rozstęp, czyli różnica pomiędzy największym i najmniejszym wynikiem w próbie. Wynik wątpliwy xw odrzuca się wówczas, gdy obliczona wartość Q jest większa od wartości krytycznej Qk.