Cours dHmostase DUT ABB 3 Exploration de la

Cours d'Hémostase DUT ABB 3 - Exploration de la Coagulation Auteur : Bruno Flamand, IUT de Dijon

Quand explorer la coagulation ? • Manifestations cliniques hémorragiques • Incident hémorragique per- ou post-opératoire • Bilan pré-opératoire • Thromboses • Surveillance traitement anticoagulant

Schéma simplifié de la coagulation Voie endogène Voie exogène Facteurs Contacts Facteur Tissulaire PK, KHPM, XIIa, XIa, IXa VIIa PL Ca 2+ VIIIa PL Ca 2+ X Xa PL Ca 2+ Va II Fibrinogène IIa Fibrine

Mesure du Temps de Quick (TQ) ou Taux de Prothrombine (TP): Exploration de Fonctionnalité Voie exogène Facteur Tissulaire Réactifs: VIIa • Thromboplastine tissulaire = Facteur Tissulaire + PL PL Ca 2+ • Ca. Cl 2 • Plasma X Xa PL Ca 2+ Va II Fibrinogène IIa Fibrine

Mesure du Temps de Quick Temps de formation d’un caillot de fibrine d’un plasma déplaquetté, décalcifié, en présence de FT, PL et Ca 2+ Thromboplastine tissulaire calcique préchauffée à 37°C 200µl Stop Chrono Plasma 100µl Déclenchement Chronomètre Préchauffage 2 min 37°c TQ Caillot Fibrine • N = 11 -13 sec • Expression TQ en pourcentage Taux de Prothrombine (TP): besoin étalonnage Droite de Thivolle

Etalonnage: Mesure TQ sur Plasmas calibrés TP 100%, 50%, 33%, …. Droite de Thivolle TQ sec 100 50 %TP 33 • TP Pathologique si < 70% = TQ allongé • Expression TQ en INR (International Normalized Ratio) : réservé aux surveillances de patients traités aux Anti. Vitamines K ( ) TQ Patient ISI INR= TQ Témoin ISI: Indice de Sensibilité Internationale de la thromboplastine

Mesure du Temps de Céphaline + Activateur (TCA): Exploration de Fonctionnalité Voie endogène Facteurs Contacts Réactifs: PK, KHPM, XIIa, XIa, IXa • Activateurs « Contacts » : Kaolin, Silice, Célite, Acide éllagique PL Ca 2+ VIIIa • Substitut PL: Céphaline X • Ca. Cl 2 Xa PL Ca 2+ Va II Fibrinogène • Plasma IIa Fibrine

Mesure du Temps de Céphaline + activateur Temps de formation d’un caillot de fibrine d’un plasma déplaquetté, décalcifié, en présence d’activateur des facteurs « contacts » , de PL et de Ca 2+ Ca. Cl 2 préchauffé à 37°C 100µl Stop Chrono Activateur 100µl Plasma 100µl Déclenchement Chronomètre Préchauffage 3 min 37°c TCA Caillot Fibrine • N: 30 -35 sec • Résultat exprimé en secondes par rapport à un plasma Témoin normal TCA Patient > 1, 2 • TCA allongé si ratio TCA Témoin

Détection de la formation du caillot de Fibrine • « Lectures oculaires » Technique du crochet accrochage caillot/filament gélatineux Barreau aimanté en rotation Bain-marie électromagnétique arrêt de rotation du barreau

• « Lecture électromagnétique » sur semi- ou automates complets Bille aimantée Micro-cuvette immobile Bobine électromagnétique Oscillation pendulaire de la bille ralentissement puis arrêt mouvement pendulaire par caillot fibrine Micro-cuvette en rotation Bille aimantée « Ergot central » Aimant Immobilité de la bille par aimantation emprisonnement dans caillot de fibrine provoque mise en rotation associée à la micro-cuvette

• « Lecture optique » par turbidimétrie à 650 nm: moins utilisée - DO départ: turbidité plasma (+réactifs) -variation DO: addition réactif déclenchant -variation DO: formation caillot fibrine

-Sur semi- ou automates complets, • Déclenchement chrono simultané à addition réactif « déclenchant » (Thromboplastine pour TQ, Ca. Cl 2 pour TCA) par pipette reliée électriquement • Arrêt Chrono automatique par détection caillot fibrine: - arrêt mouvement pendulaire bille (diminution intensité champ magnétique) - mise en rotation bille (coupure champ magnétique) - changement de turbidité -Sur semi-automates, • Addition manuelle: plasma, réactif « déclenchant » -Sur automates complets, • Travail sur Tube primaire Sang centrifugé (Anticoagulant Citrate de Na+ 3, 8%), tous les additions de réactifs sont automatisées

Allongement isolé TQ: • Déficit VII • Effet Inhibiteur : -thérapeutique: (présence héparine, en principe pas d’allongement sauf si [Héparine] importante), début traitement Anti-Vitamine K -pathologique: (Anticoagulants circulants) Ac anti-facteurs, Ac anti-phospholipides Allongement isolé TCA: • Déficit PK, KHPM, XII, XI, IX, VIII • Effet Inhibiteur: -thérapeutique: héparine, et AVK -pathologique: Ac anti-facteurs, Ac anti-phospholipides

Allongements associés TQ et TCA: • Déficit facteur voie commune: X, V, II, I • Dysfibrinogénémie • Déficits combinés: Vexo + Vc, Vendo + Vc, Vexo + Vendo (+ Vc) • Effets inhibiteurs: Ac anti-facteurs, Ac anti-phospholipides, Inhibiteurs polymérisation (PDF, anti-polymérase) • Inhibiteurs thérapeutiques: héparine, AVK

Mesure du Temps de Thrombine (T T) Exploration de Fonctionnalité de la Fibrinoformation Temps de formation d’un caillot de fibrine d’un plasma déplaquetté, décalcifié, en présence d’une quantité standardisée de thrombine diluée et de Ca 2+ Thrombine calcique préchauffée à 37°C 200µl Plasma 200µl Stop Chrono Déclenchement Chronomètre Préchauffage 2 min 37°c TT Caillot Fibrine • N 22 sec • Réalisé si TQ et TCA allongés • Si TT allongé: investigations supplémentaires (PDF, DDimères, Fibrinogène « immunologique » )

Allongements TT (et TQ et TCA) • Présence héparine • Déficit fibrinogène • Dysfibrinogénémie • Inhibiteur Fibrinoformation: PDF, Anti-polymérase

Dosage chronométrique du Fibrinogène -dosage indirect, car mesure d’un temps d’apparition de fibrine par transformation de la totalité du fibrinogène présent -temps de coagulation à 37°C d’un plasma dilué, citraté, déplaquetté, en présence de thrombine concentrée, est inversement proportionnel à la quantité de fibrinogène Thrombine calcique préchauffée à 37°C 200µl -dosage quantitatif et qualitatif Déclenchement Chronomètre -besoin étalonnage Plasma 200µl Temps de coagulation en sec. 1, 5 • N : 2 à 4 g/L 3 6 Stop Chrono Préchauffage 2 min 37°c Caillot Fibrine Temps de coagulation Fibrinogène g/L

Dosage chronométrique isolé de facteur de la coagulation -Plasmas réactifs déficients en un seul facteur -Temps de coagulation d’un plasma déficitaire est fonction de la quantité du facteur apporté par le plasma à tester -Résultats exprimés en % de facteur par rapport à des plasmas normaux étalons

Dosage chronométrique facteur VIII Activateurs Facteurs contact Plasma déficitaire en VIII 100µl Dilution Plasma Patient 100µl Ca. Cl 2 préchauffé à 37°C 100µl Stop Chrono Déclenchement Chronomètre Préchauffage 3 min 37°c • Etalonnage Caillot Fibrine Temps de coagulation en sec. %VIII N: 60 -150% 15 45 95

Dosage chronométrique facteur VII Thromboplastine tissulaire calcique préchauffée à 37°C 200µl Stop Chrono Plasma déficitaire en VII 100µl Dilution Plasma Patient 100µl Déclenchement Chronomètre Préchauffage 2 min 37°c • Etalonnage • N: 70 -130% Caillot Fibrine Temps de coagulation en sec. %VII 15 45 95

Dosage chromogénique isolé de facteur de la coagulation -Dosage colorimétriques (ou amidolytiques) -utilisation de substrats oligopeptidiques chromogènes: groupement paranitroaniline libère amine p. NA par coupure enzymatique -dosage d’activité enzymatique: concentration enzyme (facteur) est proportionnelle à la vitesse d’hydrolyse, mesurée par la variation absorbance à 405 nm (dosage pt final, 2 pts, cinétique…)

Dosage chromogénique facteur VIII IXa + PL Substrat CBS 48. 03 X CH 30 CO-D-Leu-Gly-Arg-p. NA Dilution Plasma Patient 100µl 4 min 37°C 3 min 37°C IXa + PL VIII X Xa DO 405 nm =[p. NA] DO à 405 nm p. NA CBS 48. 03 Etalonnage %VIII 25 50 100 200

Épreuve de correction de l’allongement isolé du TCA Activateurs 100µl Plasma Témoin N 100µl Plasma Patient 100µl Ca. Cl 2 préchauffé à 37°C 100µl Stop Chrono Préchauffage 3 min 37°c Déclenchement Chronomètre Caillot Fibrine TCA Calcul Indice de Rosner (TCA Mélange – TCA Témoin N) x 100 TCA Patient • Indice <12 : TCA Patient corrigé par Témoin: Déficits Facteurs • Indice >15: TCA Patient non corrigé par Témoin: Ac Anti. Coagulants Circulants

% correction= TCA Patient-TCA Mélange x 100 TCA Mélange • % correction > 65 %: déficit facteur • % correction < 50%: présence Ac anticoagulant circulant Rapport= TCA Mélange TCA Témoin N • Rapport < 1, 2 : déficit facteur • Rapport > 1, 2: présence Ac anticoagulant circulant