Tcnicas para el estudio de la Clula RESOLUCION
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Técnicas para el estudio de la Célula
RESOLUCION Y AMPLIACION
¿Que es este objeto? A B
B 5% 100%
A 5% 100%
El microscopio óptico
Resolución: capacidad para distinguir entre dos objetos muy próximos D: mínima distancia entre dos objetos distinguibles D – – – depende de 3 parámetros: a, apertura angular N, índice de refracción l, longitud de onda de la luz incidente 0, 61 l N sen a Límite de Resolución (D): D= D= 0, 61 x 450 nm 1, 5 x 0, 94 = 194 nm (≈ 0, 2 µm) N sena 1. 5
Dos sistemas para mejorar el contraste en microscopía óptica
Obtención de preparaciones permanentes para microscopía de campo claro 1º) FIJACION: con disolventes/reactivos orgánicos (metanol, paraformaldehido, glutaraldehído. . . ): - mata, estabiliza químicamente y preserva a las células - las hace permeables a colorantes - entrecruza proteínas y lípidos 2º) INCLUSION: - parafina o resinas plasticas -aumenta la consistencia/resistencia mecánica de la muestra 3º) CORTE: - microtomo: normal o de congelación - secciones de 1 -10 µm, cortes “finos”
Preparación de células de tejidos para microscopía óptica
Obtención de preparaciones permanentes (cont. ) 4º) TINCION: con colorantes - aumento del contraste - Verde Malaquita, Negro Sudán, Rojo Nilo, Azul de Coomasie - Hematoxilina (núcleos) / eosina (citoplasma) 5º) MONTAJE: - protección física de la muestra - estabilización (foto)química para alargar la vida útil - glicerol tamponado, Mowiol
Extremo radicular de una planta teñido con hematoxilina Células de los conductos colectores urinarios (riñón). Hematoxilina/eosina
Marcaje citoquímico Células de músculo esquelético humano teñidas para la enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa
Interferencia entre ondas luminosas Efectos de borde
La luz que pasa a través de una célula puede sufrir refracción y difracción
El camino óptico en el microscopio de contraste de fases
Adipocitos en cultivo
Adipocitos vistos con óptica de Nomarski
Larva recién eclosionada del nemátodo C. elegans. (interferencia de Nomarski)
Micrografías a intervalos seriados que muestran el movimiento de un fibroblasto
A B Los antiguos microscopios proporcionaban imágenes detalladas de las células. (A) Eduard Strasburger (1880) dibujó una célula vegetal viva (célula capilar de la flor. Tradescantia), cuya división observó durante un periodo de 2, 5 horas. (B) Una célula equivalente fotografiada con un microscopio moderno.
Cuatro imágenes del un fibroblasto en cultivo Campo claro Contraste de fases Nomarski Campo oscuro
Procesamiento digital de imágenes Nomarski + DP Microtúbulos no teñidos (diametro, 0, 025 µm)
Esquema óptico de un microscopio de fluorescencia
El proceso de fluorescencia E = hn
Espectros de excitación y emisión de fluorocromos comunes
Colorantes fluorescentes
Inmunofluorescencia indirecta
Citoesqueleto cortical de una célula epitelial Micrografía electrónica Inmunofluorescencia: tubulina
Triple marcaje en microscopía de fluorescencia MTs: verde Centrómeros: rosa DNA: azul
El microscopio confocal
El microscopio confocal (cont. )
Filamentos de actina en células de gástrula de Drosophila MF Confocal
Inmunofluorescencia de células He. La teñidas con anti-tubulina MF convencional Confocal
Ovulo fertilizado de erizo de mar teñido con anti-tubulina MF convencional Confocal
Cola de un embrión de pez cebra (confocal) sección 3 D a nivel de las flechas
Reconstrucción 3 D a partir de imágenes confocales Grano de polen
Secciones ópticas representativas (7) seleccionadas a partir de 81 planos confocales (correspondientes a una profundidad de 50 mm) "cortados" a través de una matriz de colageno con fibroblastos marcados con anticuerpos fluorescentes anti-tubulina. Inset, composite shadow-projection image of all 81 confocal sections revealing the spindle apparatus of dividing cells and the regular microtubular network of interphase cells
Microscopía de deconvolución La deconvolución es un proceso por el que, utilizando un software adecuado, se puede reenfocar una imagen desenfocada. La deconvolución tiene lugar tras la adquisición de la imagen, y utiliza unos algoritmos de proximidad para extraer la información de las regiones borrosas de una imagen para “limpiarlas”. Imagen “cruda” Imagen post-deconvolución Schizosaccharomyces pombe
Microscopía de deconvolución (cromosomas politénicos de Drosophila) MF convencional deconvolución
Microscopía de deconvolución marcaje: DNA (azul), MTs (verde) y MFs (rojo)
Secciones ópticas de la ovocámara de Drosophila, obtenidas por microscopía de deconvolución plano sencillo 3 D
Esquema de un microscopio electrónico de transmisión 2 m
Microscopía electrónica de transmisión (TEM) • Funciona en el vacío • Como fuente de iluminación, un chorro de electrones cuya l asociada es l� = √ 1, 5 / V • Generalmente, las muestras se fijan, incluyen, cortan y tiñen con materiales opacos a los electrones Técnicas especiales: • Sombreado metálico: visualización de la superficie de estructuras y componentes subcelulares • Microscopía crioelectrónica: visualización de muestras no fijadas ni teñidas • Criofractura y grabado profundo (freeze etch): visualización del interior de las membranas
Límite de resolución del microscopio electrónico Teóricamente, Si V = 100 k. V, l� = 0, 004 nm D= 0, 61 l N sen a ÞD = 0, 002 nm En la práctica, ~0, 2 nm, para materiales distancia entre átomos de Au: 0, 2 nm debido a las imperfecciones de las lentes electromagnéticas, al contraste de las muestras y a la lesión por radiación, la resolución en muestras biológicas de la TEM es de ≈ 2 nm
Preparación de muestras en microscopía electrónica Fijadores usados en EM En TEM se usan secciones ultrafinas (<0, 1 µm): ultramicrotomo
Rejilla de cobre utilizada para cortes ultrafinos en TEM
Sección ultrafina de una célula del meristemo radical de una gramínea
Reconstrucción 3 D a partir de imágenes seriadas
Tomografía de una mitocondria (a) Imagen 3 D del interior de una mitocondria. C, crestas; IM, membrana interna; OM, membrana externa. (b) Sección de 5 nm del mismo tomograma mostrando numerosos sitios de contacto entre la OM y la IM. Barra, 0. 4 µm.
Inmunomarcaje en TEM
Inmunodetección con oro coloidal: huso del cuerpo polar de levadura anticuerpos contra:
El microscopio electrónico de barrido (SEM)
Flor de trigo en desarrollo
Estereocilios del oído interno
SEM de alta resolución con cañón de emisión de e-
Microscopía electrónica de transmisión (TEM) Técnicas especiales: • Sombreado metálico: visualización de la superficie de estructuras y componentes subcelulares. • Microscopía crioelectrónica: visualización de muestras no fijadas ni teñidas. • Criofractura y grabado profundo (freeze etch): visualización del interior de las membranas.
Preparación de una réplica metalizada de la superficie de una muestra
Sombreado metálico Filamentos de actina/miosina
Tinción negativa
Filamentos de actina en tinción negativa
Criofractura y grabado por congelación (freeze-etching)
Obtención de replicas por criocongelación
Criofractura de la membrana plasmática
Criofractura y grabado profundo
Criofractura de la membrana tilacoidal de un cloroplasto
Filamentos musculares de un insecto preparación de muestra: congelación en He, criofractura y grabado profundo + sombreado
Célula de raíz de cebolla Criofractura que muestra los poros nucleares. N: envuelta nuclear er = retículo endoplásmico; cm = matriz citoplasmica.
espículas de superficie Microtomografía electrónica Cubierta del HBV cápside
Estructura 3 D del ribosoma 70 S de E. coli, determinado por microtomografía electrónica
