DNA Cloning Primers universali sequenza di ogni DNA

DNA Cloning

Primers universali sequenza di ogni DNA clonato

Shotgun sequencing Sequenziare un largo numero di inserti plasmidici (5 -10 genomi equivalenti) Allineamento computerizzato delle sequenze in contiguous assemblies (contigs) Genomi parziali ordinare in un contig unico (Cromosoma) Genomi completi

Second generation sequencing No clonal amplification Massively Parallel Sequencing sequencing ~Gb per day

Genomic DNA is fragmented. Adaptors ligated to ends Modified fragments attached to beds

Amplification on beds

Picotiter plate 106 wells

Each bead is added to a fibre-optic well

Pyro-sequencing 1. Nucleotides pumped sequentially across the plate 2. ~ 1 million reads obtained during 1 run 3. Addition of nucleotides generates a light signal in individual beads

d. ATP, d. CTP, d. GTP, d. TTP are sequentially added and removed. Incorporation releases pyrophosphate (PPi)

LIGHT

Light is recorded by a camera

Informazioni derivate dal sequenziamento identificazione di tutti i potenziali prodotti genici

+1 +2 +3 -1 -2 -3

ORFs Open Reading Frames

ORF selection (criteria) 1. Size >30 -40 aa 2. presence of ribosomal binding site AUG 3. Codon usage

Ricerca di omologie (sequenze codogeniche conservate in altre specie) Ricostruzione metabolica

Hypothetical proteins 20 -30% of total ORFs Real ? Functional?

orf 1 orf 2 orf 3 orf 4 orf 1 orf 1 orf 1 orf 1 orf 1 orf 1 orf 1 orf 1 orf 1 orf 1 orf 1 Gene array

Sonde Ibridazioni molecolari DNA dello stesso ceppo DNA di altri ceppi

RNA (terreno A) RNA (terreno B)

Un segmento di DNA potrebbe essere Trascritto, ma non tradotto in proteina

2 D gel electrophoresis of proteins mass proteoma charge

Un gene batterico potrebbe essere trascritto (e/o tradotto) solo durante una infezione (in vivo), ma non in Condizioni di crescita di laboratorio (in vitro)

Genoma del ceppo A Genoma di un secondo ceppo B Genoma di un terzo ceppo C A=B=C ? pangenoma

Streptococcus agalactiae nuovi geni identificati ceppi sequenziati

33 nuovi geni per ogni nuovo ceppo di S. agalactiae sequenziato

Pangenoma: insieme di geni Identificati in individui della stessa specie Core genome Variable genome

2100 genes � 4700 genes >20000 genes E. coli Core genome Average genome pangenome

Pangenomi chiusi Specie che vivono in nicchie isolate o hanno scarsa capacità di scambio genetico Bacillus anthracis pangenoma definito da 4 soli genomi

Regioni contenuto GC anomalo GC totale 47. 3% 54. 0% 52. 7% 44. 3% 42. 5% DNA acquisito da altre specie

GENOMIC ISLANDS (GEIs) 20 -120 kb 7 -20 kb Island Islet

GEI

apatogeno

PATHOGENICITY ISLANDS Contengono geni coinvolti nella patogenesi

Microbiological assays

A species includes strains: pathogenic apathogenic virulent hypervirulent Strain isolated microbe cultivated in the lab Isolate microbe from a patient, plant, etc

How to distinguish species strains? Serological analyses Changes in the composition of surface proteins and sugars O 157 H 7, O 151 H 4 etc. Different O antigens (PS) and Flagella

Genomic analyses a) restriction enzymes b) PCR and sequencing

Digestione dell’intero genoma di un isolato analisi elettroforetica dei prodotti PFGE Pulse Field Gel Electrophoresis

A B C D E F

profili di restrizione del DNA di differenti isolati

Population structure

Multi. Locus Sequence Typing (MLST) arc aro glp pta tpi Sequenziamento di frammenti di ~400 -500 bp di 6 -7 geni house-keeping Cambi nucleotidici definiscono gli alleli 7 -digit: 2341159, 2347869, etc. profilo allelico sequence type (ST) yqi

MLST bar-code