Design de Primers Serve como um ponto de

Design de Primers. .

Serve como um ponto de partida para a replicação de DNA. A DNA polimerase não é capaz de iniciar a síntese de uma nova cadeia de DNA a partir de zero, podendo apenas adicionar a uma cadeia de nucleotídeos existentes.

Primers determinam o sucesso de uma PCR! Specificity? Proper annealing to the template?

Comprimento do Primer Determina especificidade e afeta seu anelamento com o DNA molde! • Muito curto -> baixa especificidade, resultando em amplificação não específica • Muito longo -> diminui a eficiência de ligação ao DNA molde em temperatura normal de anelamento devido à maior probabilidade de formação de estruturas secundárias, como grampos. • Comprimento ideal: Ø 18 -24 bp para PCR comum Ø 30 -35 bp para PCR multiplex

Tamanho do amplicon Ø Ø 150 -1000 bp para PCR comum, evitar >3 kb 50 -150 bp para q. PCR, evitar >400 bp Evitar amplicons muito curtos para poder distingui-los de possíveis dímeros de primers! Ø

Temperatura de melting (Tm) A temperatura na qual 50% da dupla fita de DNA se dissocia para fita simples. • Determinado pelo comprimento, composição de base e concentração dos primers e pela concentração de sal no PCR mix • Cálculo aproximado: Tm = 2(A+T) + 4(G+C) °C (indicado para <18 mer) • Utilizado para cálcular a temperatura de anelamento (Ta): Ta Opt = 0. 3 x(Tm of primer) + 0. 7 x(Tm of PCR product) – 25 • Regra geral: Ta = Tm-5°C

Temperatura de anelamento (Ta) Ta ótima • 52°C - 60°C • Ta baixo aumenta a eficiência da PCR mas diminui a especificidade • Ta alto aumenta a especificidade mas diminui eficiência da PCR. • Ta >65°C pode ser recomendado para a amplificação de alvos com elevado conteúdo de GC. Diferenças de Ta entre o par de primers • Incompatibilidade significativa do par de primers pode levar à má amplificação • Desejável diferença Ta <5°C

Para determinar a Ta ótima sempre testar os primers pela 1ª vez em pelo menos 3 diferentes temperaturas (ex. a Ta indicada pelo fabricante ou calculada +/- 2°C) e correr gel! Escolher a máxima temperatura em que há apenas 1 banda (e do tamanho esperado!) e a amplificação ainda é satisfatoria!

Especificidade e homologia cruzada Especificidade • Determinada principalmente pelo comprimento do primer assim como sua sequência • A adequação da especificidade do primer é relativo à natureza do DNA molde utilizado na reação de PCR. Homologia Cruzada • Pode ser um problema quando o molde de PCR é o DNA genômico ou consiste de fragmentos de genes mistos. • Os iniciadores contendo a sequência altamente repetitiva são propensos a gerar produtos de amplificação não específicos, quando a amplificação de DNA genômico.

Para evitar amplificação não específica. . Além da temperatura e comprimento ideal dos primers: • BLAST dos iniciadores contra banco de dados NCBI de sequência não-redundante é uma maneira comum de evitar projetar primers que podem amplificar regiões homólogas inespecíficas. • Para PCR: Iniciadores que flanqueiam a junção intron-exon, para evitar a amplificação não-específica devido à contaminação por c. DNA. • Para q. PCR: Iniciadores que flanqueiam a junção exon-exon para evitar amplificação inespecífica devido à contaminação por g. DNA.

Conteúdo CG e repetições Conteúdo G/C do Primer • Conteúdo ideal de G/C: 45 -55% • Conteúdo semelhante para o par de primers • Recomendado C ou G na extremidade 3’ (aumentar eficiência ligação) Runs (streches de base única, ex aaaaaaa) • Repetições longas aumenta o potencial de anelamento inespecífico • O número máximo aceitável de repetições é de 4 bp Repetições (streches de di-nucleotídeos consecutiva, ex. acac) • Repetições aumenta o potencial de anelamento incorreto/inespecífico • O número máximo de repetições aceitável é de 4 di-nucleotídeos

Complementaridade - Estruturas 2árias dos primers • Atrapalham a ligação primer-molde, levando a pouca ou nenhuma amplificação • Análise de ΔG aceitável (energia livre necessária para quebrar a estrutura) Grampos • Formados por interações intra-moleculares no mesmo primer Auto-dímero (homodímero) • Formado por interações inter-moleculares entre dois iniciadores iguais Cross-dímero (heterodímero) • Formado por interações inter-moleculares entre os primers sense e antisense

Softwares. . Primer 3 (gratuito)

Primer BLAST (NCBI) – importante principalmente para fazer scan genômico e avaliar possíveis anelamentos inespespecíficos