UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS LABORATÓRIO DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS EXTRAÇÃO DE DNA E RNA ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Coleta de material biológico: Quando? De quem? Como? Tratamentos? Quanto mais fresco melhor! Quantidade aceitável Boa conservação EPI! Contenção!

Extração de DNA

1. Extração de DNA De onde podemos extrair DNA? • • • Sangue Tecidos Células de cultura Extração plasmídeos de células bacterianas Purificação de DNA de gel. . .

1. Extração de DNA Material de pacientes e controles - Lapoge Sangue total Buffy coats Amostras de tecido

1. Extração de DNA Objetivos? Objetivos PCR – tamanho? Genotipagem? Sequenciamento? Quantificação de RNA - Expressão? Integridade Pureza Quantidade

1. Extração de DNA Fundamentos 1. Lisar eritrócitos (choque osmótico) 2. Lisar leucócitos (detergentes) 3. Inativar DNAse (quelante -EDTA) 4. Precipitar/degradar proteínas (sais/proteinase) 5. Precipitar DNA (etanol) 6. Reidratação do DNA em água ou tampão

1. Extração de DNA Principais Métodos 1. Fenol-Cloróformio 2. Salting-out 3. Kits com colunas

1. Extração de DNA Fenol-Cloróformio 1. Lise I: eritrócitos 2. Lise II: leucócitos 3. Fenol-clorofórmio 4. Precipitação etanol

1. Extração de DNA • • • Barato Simples Boa quantidade Boa qualidade Estabilidade do DNA • Contaminação da amostra por fenol • Reagentes tóxicos!

1. Extração de DNA Salting-out http: //www. scielo. br/scielo. php? script=sci_arttext&pid=S 036505962008000300002

1. Extração de DNA Barato Simples Boa quantidade Boa qualidade Não tóxico Estabilidade do DNA? Sais contaminantes

1. Extração de DNA Kits

1. Extração de DNA MUITO Simples Boa quantidade Boa qualidade Não tóxico Caro Estabilidade do DNA

2. Extração de RNA: Análises de expressão Similar a extração de DNA Protocolo bem mais cuidadoso Molécula muito mais instável Amostra pode ser bem conservado em TRIzol, RNAlater, etc. ) - snapshot • É preciso separá-la do DNA • • TRIzol RNAlater Kit com colunas

2. Extração de RNA TRIzol 1. Lise I: eritrócitos 2. TRIzol (fenol-guanidina) 3. Clorofórmio 4. Precipitação etanol Pode ser usado para extração de RNA, DNA e Proteínas!

Kit com colunas

Transcrição reversa

(Nanodrop) (Quebit)

Espectrofotômetro - Nanodrop 260/230 ~1, 8 260/230 ~2, 0 260 nm – DNA/RNA 280 nm – proteína, fenol, . . 230 nm – contaminantes (carboidratos, fenol, . . )

Armazenar? Estoque DNA: -20◦C Uso (diluído) RNA: -80◦C

Enzimas de restrição

Enzima de restrição: • Endonucleases produzidas por bactérias para se defender de vírus. • Quebram o DNA em fragmentos menores, não infecciosos. • Reconhecem sítios específicos (sítios de restrição) no genoma e a corta. • São conhecidos mais de 3000 enzimas

Enzima de restrição: tipos de clivagem Fragmentação DNA! Clonagem! Genotipagem!. . .

Enzima de restrição: Detecção de SNPs RFPL: Polimorfismos de comprimento do fragmento de restrição Detecção dos polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs – single nucleotide polymorphisms). Os primers utilizados na PCR flanqueiam a região que contém, ou não, o sítio de clivagem reconhecido pela enzima de restrição utilizada. O produto da PCR é posteriormente submetido à ação da enzima de restrição.

Enzima de restrição: como ocorre a clivagem

Enzima de restrição: resultado da restrição 3´ CGTAAATCTATACGAGAATTCACGTA 5´ 2 5´ GCATTTAGATATGCTCTTAAGTGCAT 3´ 3´ CGTAAATCTATACGAGTATTCACGTA 5´ 1 5´ GCATTTAGATATGCTCATAAGTGCAT 3´ 2/2 1/2 2/2 1/1 1/2 1/1