Mtodos moleculares aplicados pesquisa de doenas infecciosas e

Métodos moleculares aplicados à pesquisa de doenças infecciosas e parasitárias Prof. Fabio Henrique Vieira Soares Farmácia 9 período Farmacêutico-Bioquímico SES-DF Especialista em Farmacologia clínica UNB Mestrando em Medicina Tropical UNB

Reação em cadeia da polimerase (PCR) • Objetivo: Promover a amplificação exponencial de cópias de DNA in vitro. • Refere-se a amplificação de um segmento específico de DNA dentro de um genoma • “fotocopiadora de DNA” • Apresentam alta sensibilidade, pois permitem a detecção acurada de um número particularmente pequeno de microorganismos/DNA

PCR • Descoberta por Kary Mullis em 1983 • Utilizou inicialmente polimerases termosensíveis • Introdução da Taq polimerase, proveniente da bactéria Thermus aquaticus, polimerase termoresistente (temp. ideal 72ºC) • Premio Nobel de química em 1993

Aplicações Gerais da PCR • • Diagnóstico e pesquisa de agentes infecciosos Estudos genéticos Medicina forense Teste de paternidade

Componentes da Reação • • Água DNA-alvo Primers Desoxinucleotídeos (d. NTPs) Mg Taq polimerase Tampão

Reação de PCR • Para a reação de PCR as reações devem ocorrer em ciclos de temperatura específicos, cada um com uma finalidade. (As temperaturas ocorrem em torno de 94ºC para desnaturação, 50ºC hibridação 72ºC alongamento), Desnaturação, pareamento e extensão.

As reações de PCR costumam ser de 25 a 45 ciclos.

Visualização dos produtos da PCR • (1)Visualização por eletroforese em gel de agarose, coradas com brometo e etídio, visualizadas por transiluminação UV; • (2) Sequenciamento dos produtos da PCR • (3) Polimorfismo no fragmento de restrição (RFLP) • (4) hibridação com probe de oligonucleotídeos espécificos e hibridação reversa

Tipos de PCR • • Transcriptase reversa PCR (RT-PCR) PCR em tempo real Nested PCR Multiplex PCR

Transcriptase reversa PCR (RT-PCR) Genomas de muitos vírus de importância clínica são compostos de RNA ao invés de DNA. Nesse caso, é necessária a realização da transcrição reversa antes de se iniciar a amplificação. • A enzima (TR)é capaz de transformar o RNA em um DNA complementar que servirá de alvo para a PCR convencional. •

Multiplex PCR • A possibilidade de utilização, na mesma reação, de mais de um par de iniciadores com amplificação simultânea de múltiplas seqüências do DNA-alvo é chamada de multiplex-PCR. Assim, mais de uma seqüência de DNA, em uma mesma amostra, podem ser amplificadas ao mesmo tempo.

Nested-PCR • A nested-PCR utiliza dois pares de iniciadores para amplificação. O primeiro par é usado para uma primeira reação, na qual os produtos desta reação submetidos a uma segunda amplificação com um outro par de iniciadores.

PCR em tempo real (real time) • Sistema de sonda Taqman; • À medida que vai ocorrendo a amplificação, a Taq. Man vai sendo degradada e há a liberação de um fluorocromo que absorve energia e emite luz; • A análise da emissão de luz é feita por um detector de sinal luminoso e um amplificador de sinal; • Permite a quantificação do produto amplificado • Não há necessidade da etapa laboriosa pós amplificação.

Oligonucleotídeos marcados

Métodos moleculares e doenças infecciosas e parasitarias • Para metodologia diagnóstica por PCR, há necessidade do conhecimento do DNA alvo de um determinado organismo para o desenvolvimento de oligonucleotídeos iniciadores (primers) ou de sondas que irão hibridizar-se especificamente com a seqüência alvo. • As seqüências descritas de mais de 1. 000 vírus e 135 bactérias têm possibilitado o desenvolvimento de testes diagnósticos promissores

Indicações para identificação molecular • Organismos que não crescem em culturas; • Controle clínico e epidemiológico das infecções; • Identificação rápida de um organismo a partir de uma suspeita clínica; • Identificação de um microorganismo já isolado em uma cultura pura

Limitações • Contaminações: Presença de substâncias na amostra capaz de inibir a extração ou amplificação do DNA, resultados falso negativos; • Resultados falso positivos, por contaminação (geralmente por reações anteriores, reagentes, tubos, bancadas) • Amplificação do material contaminante; • Técnicas geralmente mais caras, quando comparadas com as técnicas convencionais