Anlise qualitativa e quantitativa no automatizada Avaliao da

Análise qualitativa e quantitativa não automatizada Avaliação da motilidade e vitalidade

Preparo para análise seminal • Em uma lâmina, colocar 10 µl de sêmen e cobrir com uma lamínula de 22 x 22 mm • Repousar por alguns minutos • Examinar em 10 X e 40 X • Verificar o número de espermatozóides por campo

Aglutinação • A sua presença pode sugerir causa imunológica de infertilidade • Deve ser analisada em 10 campos • A sua presença deve ser relatada, e o tipo de aglutinação registrado • • Cabeça-cabeça Cauda-cauda Peça intermediária – peça intermediária Mista (vários tipos presentes)

Motilidade • Dever ser classificada nas seguintes categorias: • • Motilidade progressiva e rápida Motilidade progressiva lenta Motilidade não progressiva Sem movimento • A avaliação da motilidade dever ser feita imediatamente após a liquefação, 2 h e 6 h após a primeira avaliação

Células Epiteliais não de linhagem seminal Células redondas: Espermatogênese e células inflamatórias

Movimento Progressivo Direcional • • • Percentual de frequência 100% e 90%: Não existe 80%: Pouco frequente 70%: Frequente 60%: Muito frequente 50%: Muito frequente 40%: Pouco frequente 30%: Pouco frequente 20%: Raro 10%: Raro

Movimento Progressivo Pouco Direcional (lento) • Percentual de frequência • 60%: Raro • 50%: Frequente • 40%: Muito frequente • 30%: Muito frequente • 20%: Frequente • 10%: Raro

Movimento Progressivo Não Direcional (lento) • Percentual de frequência • 40%: Pouco frequente • 30%: Frequente • 20%: Muito frequente • 10%: Muito frequente

Vitalidade • Reflete a proporção de espermatozoides que estão "vivos“ na amostra, o método de escolha é a técnica de coloração Eosina / Nigrosina • Baseia-se na “integridade funcional da membrana plasmática viva”, que não permite a passagem do corante, enquanto a membrana das células mortas permite a passagem do corante • Espermatozoides vivos – não corados • Espermatozoides mortos – corados

Reagentes • Eosina amarela ou amarelada (Merck) – solução salina a 3%, estocar em temperatura ambiente • Nigrosina hidrossolúvel (Merck) – solução a 8% em salina • • Pesar 8 gramas de nigrosina, tornando-a pó fino em um gral Adicionar 10 ml de etanol a 95 o Levar a estufa de 100 o. C até evaporação do etanol Adicionar salina lentamente, mexendo a nigrosina até completa dissolução, completa volume em 100 ml, estocar a temperatura ambiente e filtrar periodicamente

Técnica • Colocar uma gota de sêmen bem homogeneizado sobre uma lâmina de microscopia • Adicionar 2 gotas de solução de Eosina a 3% e misturar imediatamente • Adicionar rapidamente 3 a 4 gotas de suspensão de Nigrosina a 8% e misturar imediatamente • Preparar 4 esfregaços bem grossos com a mistura acima, secando-os rapidamente (secador de cabelo) • Observar ao microscópio, com objetiva de imersão, contar 100 gametas (vivos e mortos)

Valores de referência • Acima de 70% de vivos • Necrospermia – acima de 30% de mortos

Contagem de espermatozoides • É realizada, após a liquefação total do sêmen, em câmara de contagem. • Apesar das câmaras de Horwell e de Makler serem específicas para a contagem de espermatozoides, a câmara de Neubauer (hemocitômetro) ainda é largamente utilizada.

Câmara de Neubauer • É uma lâmina de vidro espessa, com uma depressão central de contagem, adaptada ao microscópio de campo claro e ao de contraste de fases • É formada por 9 quadrados de 1 mm 2 de área total de 9 mm 2 • A depressão central é de 0. 1 mm até a superfície • A área marcada (L) corresponde a 1 mm 2 • O volume compreendido entre a superfície e a lamínula é de 0. 1 mm 3, ou 0. 1 µL total de 0, 9 mm 3

1 mm 1/25 mm 3 1/400 mm 3 1/16 mm 3 Área de 1 mm 2

Técnica • Diluir o esperma de 1/40, depois de liquefeito e homogeinizado, em solução salina a 0, 9% com 5% de formaldeido • Exemplo: 0, 1 ml de esperma + 3, 9 ml de solução diluente • Após homogeinizar bem, colocar na câmara e aguardar 5 minutos em ambiente úmido, para sedimentação dos gametas • Contar com objetiva de 40 X os 5 quadrantes e multiplicar por 80. 000 • Com concentração alta, contar o quadrante central e multiplicar por 400. 000

Outros elementos • Leucócitos, hemácias, células fagocitárias, células germinativas imaturas, células de Sertoli, células epiteliais não germinativas e resíduos celulares anucleados não diferenciados • Análise de pouco valor clínico, porém o de alguns deles (leucócitos) ajuda no diagnóstico • Bactérias no sêmen é um achado comum pode estar relacionada com infecções do trato genito-urinário • Obs: A contagem de leucócitos e hemácias devem ser realizados na Câmara de Neubauer, considerados valores normais até 1. 000 mm 3

Técnicas analíticas complementares (opcionais) • Detecção de anticorpos anti-espermatozóides • Imunobeads, teste de aglutinação macroscópica (MAR Teste) e outros • A presença destes anticorpos sugere infertilidade • Marcadores bioquímicos: • fosfatase ácida e ácido cítrico (marcadores da próstata) • frutose e prostaglandinas (vesículas seminais) • Cultura seminal

Interferentes: Medicamentos • O relato do uso de medicamentos é importante na execução do exame • Podem provocar aumento, ou diminuição das contagens e da motilidade dos espermatozóides • ácido valpróico, cetoconazol, cimetidina, fluconazol, ramitidina, anfepramona, decanoato de testosterona, fenitoína, haloperidol, sulfassalazina, reserpina, trimetopina, cafeína e outros.

• Drogas de abuso como, por exemplo: álcool, tabaco, maconha, cocaína e outras • Preservativos de látex • Temperaturas extremas de conservação da amostra (ideal entre 20 e 40ºC)