TIKUS TRANSGENIK TRANSGENIC MICE DARI KONSEP MENJADI SALAH
- Slides: 56
TIKUS TRANSGENIK (TRANSGENIC MICE) DARI KONSEP MENJADI SALAH SATU METODA UNTUK MEMPELAJARI FUNGSI GEN All images in this document is removed due to copyright Ahmad Aulia Jusuf restriction Bagian Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia 2009
Agenda ® Pendahuluan ® Definisi ® Tujuan ® Metoda ® Persiapan ® Tahapan pembuatan ® Penutup Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 2
Pendahuluan ® Penelitian “menyingkap” fungsi suatu gen v Invitro q Transfeksi Ø Ø v Gen ditransfeksikan kedalam sel tertentu pada media kultur Belum tentu sesuai dengan fungsinya pada individu Invivo 1 q Transgenik Ø Ø q Eksogen Endogen (overekspresi) Gene disruption / gene knock out Ø Gen endogen dibuat tidak aktif _____________________________________________________________1 Aguzzi A, Brandner S, Isenmann S, Steinbach JP, and Sure U : Transgenic and gene disruption in the study of neurocarcinogenesis. Glia 1995: 15: 348 -364 Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo techniques 3
Pendahuluan ® Sejarah 2, 3, 4, 5, 6 v Palmitter dan Brinster (1981) q membuat transgenic mice Ø v v Insersi gen thymidine kinase dari virus herpes kedalam sel telur tikus yang telah dibuahi Palmitter (1986), Jaenisch (1988) dan Hanahan (1989) Gordon dkk pada tahun 1983, Hogan dkk 1994 Penyuntikan gen ke dalam pronukleus zigot basic pathogenesis of various human __________________________________________________________________ q ________________2 Jusuf, A. A : Transgenic and gene disruption techniques from a concept to a tool in studying the disease. Medical Journal Of Indonesia. 1998: 7; 2 : 55 -64 R, Chen H, Trumbauer M et al : Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. Cell 1981: 27: 223 -231 4 Palmitter R. D and Brinster R. L: Germ-line transformation of mice. Annu. Rev. Genet 1986: 20; 465 -499 5 Jaenisch R : Transgenic animals. Science 1988: 240; 14681474 6 Hanahan D. : Transgenic mice as probes into complex system. Science 1989: 246; 1265 -1275 7 Hogan B, Constantini. F, Lacy E. : Manipulating the mouse embryos: A laboratory manual. 2 nd Ed. New York : Cold Spring Harbor: 1994 3 Brinster Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 4
Definisi ® Tikus transgenik (Transgenic mice)1, 2 v Suatu organisma (tikus) yang genom (susunan gen) nya telah dimodifikasi secara artifisial yaitu dengan cara rekayasa genetik (genetic engineering) dan dapat diturunkan q expression of exogenous gene q over-expression of endogenous gene ______________________________________________________________1 Aguzzi A, Brandner S, Isenmann S, Steinbach JP, and Sure U : Transgenic and gene disruption techniques in the study of neurocarcinogenesis. Glia 1995: 15: 348 -364 2 Jusuf, A. A : Transgenic and gene disruption techniques from a concept to a tool in studying the basic pathogenesis of various human disease. Medical Journal of Indonesia. 1998: 7; 2 : 55 -64 Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 5
Definisi ® Tikus transgenik (Transgenic mice) v Fragmen DNA atau gen yang dimasukkan kedalam suatu sel q diligasikan secara ujung ke ujung (end to end) kesuatu tempat tertentu di dalam suatu kromosom secara acak oleh ensim ligasi intraselular sehingga gen atau fragmen DNA itu akan tersusun secara tandem 2, 9 __________________________________________________________________2 Jusuf, A. A : Transgenic and gene disruption techniques from a concept to a tool in studying the basic pathogenesis of various human disease. Medical Journal of Indonesia. 1998: 7; 2 : 55 -64 9 Albert, B. , Bray, D. , Lewis, J. , Raff, M. , Roberts, K. , Watson, J. D. (1994), Cellular Mechaninsm of development in Molecular Biology of The Cell. , 3 rd Ed. , Garland Publishing, New York and London, pp. Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 6
Definisi Gen yang tersusun secara tandem gene Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 7
Definisi ® Tikus transgenik (Transgenic mice) v Integrasi transgen pada genom sel telur yang dibuahi (zigot)2, 3 integrasi fragmen DNA linier satu sama lain secara tandem oleh ensim ligase q fragmen DNA yang telah tersusun secara tandem ini akan terintegrasi di suatu tempat tertentu pada suatu kromosom tertentu secara random q Bila kromosom yang telah dimodifikasi ini terdapat pada selsel benih (spermatozoa atau ovum), maka transgen ini akan dapat diturunkan ke generasi tikus selanjutnya q Tikus yang mengandung transgen ini dikenal sebagai __________________________________________________________________ transgenic mice ________________ q 2 Jusuf, A. A : Transgenic and gene disruption techniques from a concept to a tool in studying the basic pathogenesis of various human disease. Medical Journal Of Indonesia. 1998: 7; 2 : 55 -64 3 Brinster R, Chen H, Trumbauer M et al : Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. Cell 1981: 27: 223 -231 Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 8
Definisi ® Kegunaan Tikus transgenik (Transgenic mice)2, 3, 10 v Model Hewan coba q q q mempelajari regulasi gen-gen yang terkait dengan perkembangan jaringan tubuh mempelajari regulasi gen-gen yang berperan dalam oncogenesis mempelajari gen-gen yang spesifik yang berperan dalam pertumbuhan jaringan tubuh tertentu mempelajari fenotif gen pada jaringan tubuh mempelajari efek zat atau senyawa tertentu dalam terapi penyakit _____________________________________________________________ 2 Jusuf, A. A : Transgenic and gene disruption techniques from a concept to a tool in studying the basic pathogenesis of various human disease. Medical Journal Of Indonesia. 1998: 7; 2 : 55 -64 3 Brinster R, Chen H, Trumbauer M et al : Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. Cell 1981: 27: 223 -231 10 Nagy A, Gertsenstein M, Vintersen K, Behringer R, Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. 3 rd Ed New York: Cold Spring Harbor: 2003 Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 9
Metoda Pembuatan Tikus Transgenik Metoda pronuclear microinjection dan Metoda insersi transgen kedalam ES cells _____________________________________________________ 18 Hanahan, D. , Wagner, E. F. , Palmiter, R. D. The origins of oncomice: a history of the first transgenic mice genetically engineered to develop cancer. Genes & Dev. 2007: 21: 2258 -2270 19 Transgenic mice, diunduh dari htpp: //cancer ucsd. edu/tgm/pronuclear. asp Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 10
Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik Pembuatan tikus transgenik merupakan proses yang sulit dan membutuhkan waktu yang lama ® Serangkaian persiapan yang harus dilakukan adalah ® v v Persiapan gen (transgen) yang akan dimasukkan ke dalam pronukleus telur tikus yang telah dibuahi (zigot) Persiapan tikus yang akan digunakan Persiapan alat dan bahan Persiapan sistem deteksi ada tidaknya transgen dalam susunan genom ”calon” tikus transgenik (tikus yang berkembang dari zigot yang disuntikkan transgen) Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 11
Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Persiapan v Fragmen gen (transgen) DNA atau gen (transgen) Promoter, complete protein coding region, sedikitnya satu intron dan polyadenylation site 11 q Panjang DNA pada transgen tidak dibatasi, bisa dari beberapa kilo base pair (Kbp) hingga 1000 kb (Lamb et 1999)13 q Ø Hal yang harus dipertimbangkan adalah vektor yang digunakan dan cara konstruksinya ___________________________________ 11 Brinster R, Allen J, Behringer. R, Gelimas R et al. : Intron s increase transcriptional efficiency in transgenic mice. Proc Natl. Acad. Sci. USA 1988: 85; 836 -40 12 Chada K, Magram J, Raphael K, Radice G, Lacy E and Constantini F. Spesific expression of a foreign beta globin gene in eryrthroid cells of transgenic mice. Nature. 1985: 314: 377 -380 13 Lamb B. T, Bardel K. A, Kulnane L. S. Anderson J. J, Holtz G, Wagner S. L, Sisodia S. S, and Hoeger E. J. Amyloid production and deposition Thursday, November in mutant yeast artificial chromosome transgenic mice. Natl. Neurosci. 1999: 05, amyloid 2009 precursor protein and presenilin-1 Transgenic Mice/AAJ/Histo 12 2; 695 -697
Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Persiapan gen (transgen) v Fragmen DNA atau gen (transgen) Amplifikasi fragmen DNA menggunakan PCR q Metoda biologi molekular q Harus dipurifikasi dan bebas dari sekuens vektor prokariotik 12 q Ø Tidak mengganggu proses integrasi tetapi ekspresi dari transgen ___________________________________ 11 Brinster R, Allen J, Behringer. R, Gelimas R et al. : Intron s increase transcriptional efficiency in transgenic mice. Proc Natl. Acad. Sci. USA 1988: 85; 836 -40 12 Chada K, Magram J, Raphael K, Radice G, Lacy E and Constantini F. Spesific expression of a foreign beta globin gene in eryrthroid cells of transgenic mice. Nature. 1985: 314: 377 -380 13 Lamb B. T, Bardel K. A, Kulnane L. S. Anderson J. J, Holtz G, Wagner S. L, Sisodia S. S, and Hoeger E. J. Amyloid production and deposition Thursday, November in mutant amyloid precursor protein and presenilin-1 yeast artificial chromosome transgenic mice. Natl. Neurosci. 1999: 2; 695 -697 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 13
Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Persiapan gen (transgen) Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 14
Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Persiapan v gen (transgen) Bila gen yang diinsersikan adalah gen endogen (endogenous transgene) q q Penyisipan oligonukleotida pada daerah transgen yang tidak ditranslasikan (untranslated region)14, 15 Menginsersikan gen kecil yang mengkode RNA yang pendek pada transgen tersebut 16 ___________________________________ 14 Peschon J. J, Behringer R. R, Brinster R. L, and Palmiter R. D. Spermatide-specific expression of protamine 1 in transgenic mice. Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1987: 84; 5316 -5319 15 Shi Y, Son H. J, Shahan K, Rodriguez M, Constantini F and Derman E. Silent genes in the mouse major urinary protein gene family. Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1989: 86; 4584 -4588 16 Krumlauf R, Hammer R. E, Tilghman S. M, and Brinster R. L Developmental regulation of alpha-fetoprotein genes in transgenic mice. Mol. Thursday, November Cell. Biol. 1985: 5; 1639 -1648. 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 15
Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Persiapan v gen (transgen) Bila gen yang diinsersikan adalah gen endogen (endogenous transgene) q Fusi epitope/peptida yang pendek dengan protein dari transgen mempermudah pengenalan protein yang dikode oleh transgen menggunakan epitope-specific antibodi l fusi antara protein yang dikode oleh transgen dengan protein ”green fluorescent Protein (GFP)” yang dikode oleh gen reporter alkaline phosphatase 17 Ø protein kecil yang ”mendompleng” pada protein yang dikode oleh transgen mungkin berpengaruh terhadap fungsi protein ___________________________________ yang dikode oleh transgen Ø 17 van Roessel P and Brand A. H. Imaging into the future: visualizing gene expression and protein interactions with fluorescent proteins. Nat. Cell. Biol. 2002: 4; 15 -20 Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 16
Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Persiapan v gen (transgen) Efisiensi transgen yang ditransfer dipengaruhi oleh beberapa faktor 8 q Bentuk DNA Ø q Konsentrasi DNA Ø Ø Ø q Konsentrasi DNA yang rendah akan menurunkan efisiensi pengintegrasian transgen Konsentrasi yang terlalu tinggi bersifat toksik bagi zigot Konsentrasi DNA yang dianjurkan adalah 1. 5 -2 nanogram/mikroliter Kemurnian DNA Ø q Bentuk linier dari DNA transgen akan meningkatkan efisiensi integrasi transgen DNA yang diinsersikan harus bebas dari kontaminasi (sisa phenol, etanol atau ensim) Buffer DNA Buffer berperan dalam meningkatkan efisiensi pengintegrasian __________________________________ transgen pada hostnya 8 Hogan B, Constantini. F, Lacy E. : Manipulating the mouse embryos: A laboratory manual. 2 nd Ed. New York : Cold Ø Pelarut yang sering dipakai adalah TE buffer yang mengandung 1 m. M Spring Harbor: EDTA. 1994 10 Ø Nagy A, Gertsenstein M, Vintersen K, Behringer R, Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. 3 rd Ed New York: Cold Spring Harbor: 2003 Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 17
Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Persiapan tikus v Superovulated female mice q Kelompok tikus betina yang dibuat superovulasi (superovulated female mice) Ø Ø Ø Menghasilkan telur yang dibuahi (zigot) dalam jumlah banyak Pregnant Mare’s Serum Gonadotrophin (PMSG) l serupa dengan hormon FSH l stimulasi perkembangan dan pematangan telur tikus dalam jumlah banyak Human Chorionic Gonadotrophin (HCG) l menstimulasi ovulasi Tikus dewasa dengan umur 4 -8 minggu Dikawinkan dengan tikus jantan kelompok fertile stud male mice l cek plug kopulasi (copulation plug) besok paginya Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 18
Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Persiapan tikus v Fertile stud male mice q q q v Kelompok tikus jantan pengawin (fertile stud male mice) mengawini tikus betina superovulated female mice berumur 6 -8 minggu dan mempunyai penampilan reproduksi yang baik Sterile male mice q q kelompok tikus jantan yang telah disterilkan dengan cara vasektomi dikawinkan dengan tikus betina pseudopregnant female mice berumur sediktinya 2 bulan Sebelum dipakai dicek ke ”steril” annya Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 19
Vasektomi Pada Sterile Male Mice Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 20
Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Persiapan tikus v Pseudopregnant mice q q q kelompok tikus betina yang dibuat hamil palsu (pseudopregnant female mice) menerima zigot yang telah mengandung transgen dalam pronukleusnya dikawinkan dengan tikus kelompok sterile male mice berumur 6 -8 minggu dengan berat badan antara 25 -35 gram Untuk mempermudah transfer zigot disarankan untuk menggunakan tikus yang mempunyai infundibulum yang besar Ø strain ICR Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 21
Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Persiapan alat dan bahan v Alat dan bahan untuk mengumpulkan telur tikus yang dibuahi (zigot) q q Spuit disposible Hormon Pregnant Mare’s Serum Gonadotrophin (PMSG) Hormon Human Chorionic Gonadotrophin (HCG) Larutan kultur Ø q q q q larutan D-PBS atau larutan lainnya l ditambahkan bovine serum albumin (BSA), asam piruvat dan antibiotik (penisilin dan streptomisin) Larutan kultur yang mengandung ensim hyaluronidase Inkubator (temperatur 37 C, dengan kelembaban 95% dan mengandung 5% CO 2) Surgical set termasuk watchmaker’s forceps Alkohol 70% Stereomikroskop Mouth controlled pipette 35 mm petri dish Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 22
Mouth controlled pipette Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 23
Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Persiapan alat dan bahan v Alat dan bahan yang dipakai untuk menginsersikan transgen ke pronukleus zigot q Holding pipette Ø q pipet yang dipakai untuk “memegang” zigot selama proses penyuntikan transgen ke dalam pronukleus zigot l Borosilicate glass capilary l mechanical pipette puller Injection pipette Ø Ø Ø pipet yang dipakai untuk memasukkan transgen kedalam pronukleus zigot Glass capillary tubing dengan internal glass filament mechanical pipette puller Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 24
Holding dan injection Pipette Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 25
Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Persiapan alat dan bahan v Alat dan bahan yang dipakai untuk menginsersikan transgen ke pronukleus zigot q q Mikroskop yang mempunyai mikromanipulator Paraffin oil Petri dish injection chamber Transgen yang dilarutkan dalam buffer TAE Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 26
Persiapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Persiapan alat dan bahan v identifikasi ada tidaknya transgen pada tikus host q q q Southern blot Northern blot Western Blot Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 27
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 28
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Penyuntikan hormon PMSG dan HCG Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 29
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Isolasi dan pengumpulan telur tikus yang dibuahi (zigot) dari superovulated female mice dengan plug kopulasi positif Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 30
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Isolasi dan pengumpulan telur tikus yang dibuahi (zigot) dari superovulated female mice dengan plug kopulasi positif Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 31
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Isolasi dan pengumpulan telur tikus yang dibuahi (zigot) dari superovulated female mice dengan plug kopulasi positif Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 32
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Isolasi dan pengumpulan telur tikus yang dibuahi (zigot) dari superovulated female mice dengan plug kopulasi positif Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 33
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Isolasi dan pengumpulan telur tikus yang dibuahi (zigot) dari superovulated female mice dengan plug kopulasi positif Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 34
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Penyuntikan transgen kedalam pronukleus telur tikus yang dibuahi (zigot) Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 35
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Penyuntikan transgen kedalam pronukleus telur tikus yang dibuahi (zigot) Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 36
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Penyuntikan transgen kedalam pronukleus telur tikus yang dibuahi (zigot) Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 37
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Penyuntikan transgen kedalam pronukleus telur tikus yang dibuahi (zigot) Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 38
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Penyuntikan transgen kedalam pronukleus telur tikus yang dibuahi (zigot) Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 39
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Penyuntikan transgen kedalam pronukleus telur tikus yang dibuahi (zigot) Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 40
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Penyuntikan transgen kedalam pronukleus telur tikus yang dibuahi (zigot) Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 41
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Penyuntikan transgen kedalam pronukleus telur tikus yang dibuahi (zigot) Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 42
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Transfer zigot yang telah mengandung transgen ke saluran telur (oviduct) pseudopregnant female mice Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 43
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Transfer zigot yang telah disuntikkan transgen ke saluran telur (oviduct) pseudopregnant female mice Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 44
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Transfer zigot yang telah disuntikkan transgen ke saluran telur (oviduct) pseudopregnant female mice Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 45
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Pemeliharaan “Calon” Tikus Transgenik Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 46
Tahapan Pembuatan Tikus Transgenik ® Deteksi Transgen Pada “Calon” Tikus Transgenik Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 47
Penutup Telah diuraikan tehnik pembuatan tikus transgenik (transgenic mice) ® Pembuatan tikus transgenik membutuhkan proses yang panjang dan waktu yang lama ® Kegunaan tikus transgenik ® v v mempelajari regulasi gen-gen yang terkait dengan perkembangan jaringan tubuh dan gen-gen yang spesifik pada jaringan tertentu Mempelajari fenotif gen pada jaringan tubuh Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 48
Penutup Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 49
Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 50
Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 51
Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 52
Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 53
Penutup “ Dan Allah telah meratakan bumi untuk kehidupan mahluk. Nya Dibumi itu ada keaneka ragaman buah-buahan Dan pohon kurma yang mempunyai kelopak mayang Dan biji-bijian yang berkulit Dan bunga-bunga yang harum baunya Maka nikmat Tuhanmu yang manakah yang kamu dustakan? ” (QS : Ar-Rahman (55) : 10 -13) Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 54
Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 55
Thursday, November 05, 2009 Transgenic Mice/AAJ/Histo 56
