TERAPIA GENICA anno accademico 2019 2020 Dott ssa

  • Slides: 40
Download presentation
TERAPIA GENICA anno accademico 2019 -2020 Dott. ssa Luigia Morciano U. O. C. Pediatria

TERAPIA GENICA anno accademico 2019 -2020 Dott. ssa Luigia Morciano U. O. C. Pediatria - Genetica Medica Osp. “Card. G. Panico” - Tricase

La TERAPIA GENICA …scienza giovane: 1990 una bambina affetta da SCID (grave immunodeficienza ereditaria)

La TERAPIA GENICA …scienza giovane: 1990 una bambina affetta da SCID (grave immunodeficienza ereditaria) Trasferire materiale genetico (DNA) per prevenire o curare una malattia GENE DIFETTOSO o ASSENTE : trasferire la versione funzionante del gene nell’organismo del paziente per rimediare al difetto - Soppressione mirata di cellule patologiche (trasferimento genico contro il cancro) - Trasferimento di geni all’interno di cellule malate allo scopo di bloccare il meccanismo alterato che causa la malattia

Terapia genica su cellule somatiche Terapia genica su cellule germinali Terapia genica su cellule

Terapia genica su cellule somatiche Terapia genica su cellule germinali Terapia genica su cellule somatiche Si propone di modificare solamente le cellule somatiche, senza intaccare la linea germinale (più studiata e sperimentata) Terapia genica su cellule germinali Si propone di trasfettare le cellule della linea germinale (spermatozoi , ovociti, cellule staminali totipotenti dei primissimi stadi 4 -8 cellule dello sviluppo dell'embrione) … ragioni etiche…maggiori difficoltà tecniche

TERAPIA GENICA CELLULE SOMATICHE Insieme di procedimenti atti a curare o alleviare una malattia

TERAPIA GENICA CELLULE SOMATICHE Insieme di procedimenti atti a curare o alleviare una malattia modificando geneticamente le cellule dei pazienti Possibili strategie: in vivo: trasferimento diretto nel corpo del paziente ex vivo: trasferimento nelle cellule prelevate e reinserimento nel paziente

La terapia genica ex vivo Prelievo delle cellule somatiche del paziente…messe in coltura in

La terapia genica ex vivo Prelievo delle cellule somatiche del paziente…messe in coltura in laboratorio… transfettate con il gene d'interesse inserito tramite un apposito vettore (vettori virali) Successivamente reinfuse o reinmpiantate nel corpo del paziente Procedura lunga e costosa…capace di selezionare ed amplificare le cellule d'interesse Modalità più utilizzata ma riservata ai casi in cui è possibile prelevare, coltivare e reinserire le cellule nell'organismo

La terapia genica in vivo Se le cellule non possono essere messe in coltura,

La terapia genica in vivo Se le cellule non possono essere messe in coltura, prelevate e reimpiantate (cervello, cuore, organi interni) Modello terapeutico con elevate complicanze Molto economico ma di più difficile applicazione. Gene o Oligonucleotide d'interesse viene inserito nell'organismo, tramite un opportuno vettore, direttamente per via locale o sistemica. I sistemi attualmente studiati sono di tre tipi: lipoplessi, poliplessi, lipopoliplessi

TERAPIA GENICA “DIRETTA” ED “INDIRETTA” 1) Terapia genica "diretta” Alterazione di una sequenza di

TERAPIA GENICA “DIRETTA” ED “INDIRETTA” 1) Terapia genica "diretta” Alterazione di una sequenza di DNA, responsabile della trasformazione maligna o del suo mantenimento Esempi : ablazione di oncogeni aggiunta di geni oncosoppressori (assenti o mutati) 2) Terapia genica "indiretta” Controllo della crescita tumorale e della morte cellulare mediante inserimento di sequenze geniche agiscono da step intermedio Esempi : Stimolazione delle risposte immunitarie anti-tumorali Alterazioni della angiogenesi tumorale Inserimento di enzimi per la trasformazione di "pro-drug”

Come trapiantare i nuovi geni ? Come "veicolare" il DNA esogeno all'interno delle cellule?

Come trapiantare i nuovi geni ? Come "veicolare" il DNA esogeno all'interno delle cellule? 3 miliardi di cellule compongono l'organismo umano Il DNA deve arrivare…pilotato… solo nelle cellule che richiedono un intervento terapeutico METODO: introdurre il DNA all'interno delle cellule con TRASFEZIONE di DNA nudo Il DNA viene mescolato con fosfato di calcio (Ca. Pi) e DEAE destrano e somministrato a cellule in coltura digestione

Strategie terapeutiche ADDITIVA : m. RNA viene trascritto e tradotto nella proteina deficitaria (es.

Strategie terapeutiche ADDITIVA : m. RNA viene trascritto e tradotto nella proteina deficitaria (es. difetto metabolico) ABLATIVA : - transgene antisenso - ribozima, transgene codificante RNA con attività catalitica (es. oncogene o virus patogeno)

VETTORE OTTENERE TRASFERIMENTO GENICO POSSIBILITA’ DI TRASMISSIONE NELLA CELLULA BERSAGLIO

VETTORE OTTENERE TRASFERIMENTO GENICO POSSIBILITA’ DI TRASMISSIONE NELLA CELLULA BERSAGLIO

COME DEVE ESSERE IL VETTORE? Non deve provocare danni all’ospite per cui il virus

COME DEVE ESSERE IL VETTORE? Non deve provocare danni all’ospite per cui il virus va modificato in modo da privarlo della capacità di replicazione autonoma (consentire un solo ciclo di infezione) Inattivare i geni virali i cui prodotti possono essere nocivi

Vettore “ideale” (suo identikit) Alta efficienza di trasduzione Indipendenza dalla proliferazione delle cellule bersaglio

Vettore “ideale” (suo identikit) Alta efficienza di trasduzione Indipendenza dalla proliferazione delle cellule bersaglio Alta e stabile espressione del transgene Facile ottenimento Facile conservabilità

Metodi di trasferimento di materiale genetic DNA nudo DNA viene degradato prima di raggiungere

Metodi di trasferimento di materiale genetic DNA nudo DNA viene degradato prima di raggiungere il nucleo liposomi vettori di tipo virale

Liposomi Vantaggi: facili da preparare, possono ospitare DNA di grosse dimensioni, assenza di effetti

Liposomi Vantaggi: facili da preparare, possono ospitare DNA di grosse dimensioni, assenza di effetti indesiderati, bassa risposta immune Svantaggi: bassa efficienza, il DNA viene rapidamente degradato

Il trasferimento virale - Capacità di penetrare nelle cellule e di inserirsi nel DNA

Il trasferimento virale - Capacità di penetrare nelle cellule e di inserirsi nel DNA dell'ospite (dimensioni e struttura) - Non tutti i virus a DNA si sono dimostrati adatti - Spesso il materiale genetico da essi trasportato non si integra nei cromosomi delle cellule infettate - La maggior parte dei virus ad RNA non è adatto al trasferimento dei Geni…RNA, infatti, non si integra nel DNA delle cellule umane e viene rapidamente degradato

Il trasferimento virale VIRUS vettori per la terapia genica sono Retrovirus Lentivirus Adenovirus Virus

Il trasferimento virale VIRUS vettori per la terapia genica sono Retrovirus Lentivirus Adenovirus Virus Adenoassociati Virus Erpetici

Retrovirus Vantaggi Svantaggi Un'eccezione è fornita dai RETROVIRUS che adottano una strategia replicativa in

Retrovirus Vantaggi Svantaggi Un'eccezione è fornita dai RETROVIRUS che adottano una strategia replicativa in cui il loro genoma ad RNA viene retrotrascritto in DNA ed integrato nel genoma della cellula infettata

Adenovirus Vantaggi Svantaggi Infettano anche cellule non in divisione

Adenovirus Vantaggi Svantaggi Infettano anche cellule non in divisione

Virus adeno-associato (AAV) Parvovirus Vantaggi Svantaggi Virus a singola elica di DNA, richiedono la

Virus adeno-associato (AAV) Parvovirus Vantaggi Svantaggi Virus a singola elica di DNA, richiedono la co-infezione per completare il ciclo vitale. Vi è rischio di contaminazione con virus helper

Strategie generali (1) Terapia di incremento della dose genica Applicazione: malattie autosomiche recessive in

Strategie generali (1) Terapia di incremento della dose genica Applicazione: malattie autosomiche recessive in cui i livelli di espressione di un gene introdotto sono sufficienti per migliorare il fenotipo clinico

Strategie generali (2) Uccisione mirata di cellule tumorali Inserimento nelle cellule di a) un

Strategie generali (2) Uccisione mirata di cellule tumorali Inserimento nelle cellule di a) un gene che produce una tossina letale o b) un gene che codifica per un farmaco che conferisce suscettibilità a un altro farmaco che se somministrato uccide le cellule

Strategie generali (3) Uccisione di cellule patologiche mediata da cellule del sistema immunitario Inserimento

Strategie generali (3) Uccisione di cellule patologiche mediata da cellule del sistema immunitario Inserimento di geni che provocano o aumentano la risposta immunitaria

Strategie generali (4) Inibizione mirata dell’espressione genica

Strategie generali (4) Inibizione mirata dell’espressione genica

Terapia genica “EX VIVO” Le cellule vengono prelevate dal paziente Vengono esposte in coltura

Terapia genica “EX VIVO” Le cellule vengono prelevate dal paziente Vengono esposte in coltura Le cellule che hanno incorporato il DNA vengono iniettate nel paziente Vantaggi: - Possibilità di controllare il tipo di cellule esposte al vettore - Facilitare l’esposizione delle cellule ad elevate concentrazioni di vettore

Terapia genica ex vivo

Terapia genica ex vivo

Terapia genica “IN VIVO” Introduce il vettore direttamente nel paziente attraverso : - infusione

Terapia genica “IN VIVO” Introduce il vettore direttamente nel paziente attraverso : - infusione intravascolare - iniezione diretta in un tessuto o in un sito specifico Tecnicamente più semplice e meno complessa della precedente Permette di indirizzare il vettore verso siti non facilmente accessibili per la manipolazione “ex vivo”

Terapia genica “IN VIVO” Svantaggi: - Difficoltà nel controllare le condizioni di esposizione al

Terapia genica “IN VIVO” Svantaggi: - Difficoltà nel controllare le condizioni di esposizione al vettore - Possibile disseminazione delle sequenze ricombinanti - Possibile contaminazione involontaria della linea germinale

Terapia Genica

Terapia Genica

Terapia Genica

Terapia Genica

QUALI GENI TRASFERIRE ? IN QUALI CELLULE BERSAGLIO ? Il DNA introdotto può codificare

QUALI GENI TRASFERIRE ? IN QUALI CELLULE BERSAGLIO ? Il DNA introdotto può codificare una proteina che sostituisce un fattore deficitario Può avere un effetto terapeutico inducendo l’espressione aberrante di un normale gene dell’ospite o di un nuovo gene esogeno Agire localmente nella stessa cellula In siti a distanza

Terapia Genica

Terapia Genica

Terapia genica

Terapia genica

Sostanze farmaceutiche prodotte con la tecnologia del DNA ricombinante

Sostanze farmaceutiche prodotte con la tecnologia del DNA ricombinante

Sostanze farmaceutiche prodotte con la tecnologia del DNA ricombinante

Sostanze farmaceutiche prodotte con la tecnologia del DNA ricombinante

Quali le possibilità future? Potenziamento tecnico della metodologia del trapianto di midollo osseo *

Quali le possibilità future? Potenziamento tecnico della metodologia del trapianto di midollo osseo * Trapianto di midollo allogenico (introduzione di m. o. da un individuo ad un altro) come forma completa di terapia genica Intero genoma delle cellule midollari del paziente viene sostituito con quello di un altro individuo portatore di una copia normale del gene responsabile della malattia

Quali le possibilità future? BIOREATTORI Possono essere impiantati nel paziente per consentire la produzione

Quali le possibilità future? BIOREATTORI Possono essere impiantati nel paziente per consentire la produzione a lungo termine di proteine terapeutiche. Le cellule modificate per esprimere la proteina ricombinante sono fatte crescere in coltura in un dispositivo impiantabile ingresso uscita di sostanze nutritive proteina ricombinante

PROBLEMI ETICI Modificazione della linea germinale Tumorigenesi (es. per mutagenesi inserzionale) Imprevedibile azione nociva

PROBLEMI ETICI Modificazione della linea germinale Tumorigenesi (es. per mutagenesi inserzionale) Imprevedibile azione nociva del transgene Reazioni immunitarie aberranti dovute al vettore e/o al gene trasdotto Trasferimento genico a terze persone (in seguito alla disseminazione del vettore)

PROBLEMI IRRISOLTI DELLA TERAPIA GENICA La sicurezza della procedura: alcuni vettori derivano da virus

PROBLEMI IRRISOLTI DELLA TERAPIA GENICA La sicurezza della procedura: alcuni vettori derivano da virus pericolosi, come l’HIV. E’ quindi necessario privarli della virulenza originaria del virus e che mantengano inalterata la capacità di infettare le cellule bersaglio L’efficienza di trasferimento: la maggior parte degli sforzi si concentra sulla ricerca di vettori in grado di trasferire il DNA in modo efficiente e di inserirlo stabilmente nelle cellule. La selettività del bersaglio: in questi ultimi anni sono stati messi a punto una varietà di vettori, alcuni dei quali in grado di fare esprimere il gene estraneo in uno specifico tipo cellulare (come i globuli bianchi, le cellule del muscolo, delle vie respiratorie ecc…).

PROBLEMI IRRISOLTI DELLA TERAPIA GENICA La durata dell’espressione del gene trasferito: Le ricerche mirano

PROBLEMI IRRISOLTI DELLA TERAPIA GENICA La durata dell’espressione del gene trasferito: Le ricerche mirano a sviluppare sistemi che permettono un espressione duratura, in modo da sottoporre il paziente ad un unico trattamento, o al limite a trattamenti ripetuti a distanza di qualche anno. La reazione immunitaria: Il gene stesso e soprattutto il vettore possono scatenare una risposta immunitaria da parte dell’organismo ospite. Questa può portare all’eliminazione delle cellule modificate geneticamente, o all’inattivazione della proteina prodotta dal nuovo gene, annullando quindi tutti gli effetti della terapia. Nello sviluppo delle nuove strategie di terapia genica si cerca di evitare per quanto possibile che il vettore o il gene estraneo producano una reazione immunitaria. La terapia genica è una scienza giovane