Spettroscopia La spettroscopia n Studio delle propriet della

Spettroscopia

La spettroscopia n Studio delle proprietà della materia effettuato analizzando la sua interazione con una radiazione elettromagnetica

Interazione radiazione-materia… vediamo cosa succede…. Oggetto (es. bicchiere d’acqua con pigmento) luce riflessa luce incidente luce rifratta luce difratta luce assorbita luce trasmessa

Classificazione dei metodi spettroscopici: 1. In base alla radiazione prodotta o assorbita dagli analiti dopo irradiazione: • Metodi di emissione; • Metodi di fluorescenza; • Metodi di assorbimento 2. A seconda del tipo di radiazione elettromagnetica utilizzata: • Raggi X, UV, VIS, IR, microonde ecc….

La radiazione elettromagnetica Dualismo onda - particella Teoria ondulatoria es. Difrazione Teoria corpuscolare es. Effetto fotoelettrico

La radiazione elettromagnetica: Def. = è una forma di energia trasmessa attraverso lo spazio ad elevata velocità. • È costituita da campi elettrici e magnetici oscillanti nello spazio e nel tempo. • Il campo elettrico e magnetico sono perpendicolari tra loro ed alla direzione di propagazione dell’onda.

Un po’ di Fisica…. Sorry…. J A • Si dice lunghezza d’onda (l) la distanza spaziale tra due massimi dell’onda (sottomultipli del metro: nm, μm o cm). • La frequenza (n) è il numero di onde in un secondo correlate dalla seguente relazione: n (Hz)= c/l c è la velocità della luce. • L’ampiezza (A) rappresenta la distanza tra il massimo dell’onda e la direzione di propagazione. • Il numero d’onda n: rappresenta il numero di onde per cm (cm-1) ed è uguale a 1/λ

Energia della radiazione elettromagnetica Un po’ di matematica…. Sorry…. J Esiste una relazione tra la frequenza di una radiazione elettromagnetica e la sua energia: h = costante di Planck = 6. 626 · 10 -34 J · s üMaggiore è la lunghezza d’onda (l) di una radiazione elettromagnetica e minore è la sua energia. Quindi l’energia e la lunghezza d’onda sono inversamente proporzionali!!!! üMaggiore è la frequenza (n) di una radiazione elettromagnetica e maggiore è la sua energia. Quindi l’energia e la frequenza sono direttamente proporzionali!!

Lo spettro elettromagnatico • L’insieme di tutte le radiazioni elettromagnetiche costituisce lo spettro elettromagnetico. • Il nervo ottico umano è in grado di percepire le sole radiazioni dello spettro elettromagnetico con lunghezza d’onda (λ) comprese tra 380780 nm Radiazioni percepite dall’occhio

E

Assorbimento: cosa succede? n Stato fondamentale Þ n Stato eccitato v Þ Stato a minima energia di un particolare sistema fisico Stato ad energia più alta dello stato fondamentale Una radiazione può cedere energia alla materia solo se DE = hn !!!!

Energia Stato eccitato hn > D E Radiazione NON assorbita Stato fondamentale hn = D E Radiazione assorbita!!! hn < D E Radiazione NON assorbita Una radiazione può essere assorbita dalla materia solo se la sua energia è pari alla differenza di energia tra lo stato fondamentale e quello eccitato della molecola

I 0= Intensità della radiazione incidente I = Intensità della radiazione trasmessa l = cammino ottico (cm) T= I / I 0 Trasmittanza (T) A= -log T = -log I / I 0 = log I 0 / I Assorbanza (A)

Legge di Lambert-Beer: relazione tra assorbanza e concentrazione. A= log (I 0 / I)= ε l c ε= coefficiente di estinzione molare ( M-1 cm-1) 4. 0 3. 5 C= 8 x 10 -5 M 3. 0 A 2. 5 2. 0 C = 4 x 10 -5 M 1. 5 1. 0 C = 2 x 10 -5 M 0. 5 0. 0 350 C = 1 x 10 -5 M 400 450 500 550 600 lunghezza d'onda, nm 650 700

Limitazioni alla legge di Lambert-Beer È valida solo per soluzioni diluite (< 10 -2 M) v All'aumentare della concentrazione aumenta il numero di particelle in soluzione ed aumenta anche il numero di urti fra queste; le forze interioniche e/o intermolecolari aumentano e possono formarsi molecole o aggregati di particelle più complesse, diverse per struttura da quelle in esame, per cui si potrà avere uno spostamento del massimo di assorbimento. Deviazioni chimiche: dovute a processi di dissociazione, associazione o ancora reazione con il solvente per dare origine a nuovi prodotti che assorbono in maniera differente dall’analita iniziale. Limiti strumentali v Radiazione incidente non perfettamente monocromatica

STRUMENTAZIONE: Spettrofotometro • Sorgente di luce policromatica (tungsteno per il visibile, deuterio per l’UV) • Fessura d’ingresso-lente (per minimizzare la luce diffusa e rendere paralleli i raggi della sorgente) • Filtro o monocromatore (per selezionare una banda di l definita) • Fessura d’uscita • Cella o cuvetta • Fotomoltiplicatori (trasforma il segnale luminoso in impulso elettrico)

Esistono diversi tipi di spettrofotometro, a seconda di come sono organizzati i vari componenti: • SPETTROFOTOMETRI MONORAGGIO • SPETTROFOTOMETRI A DOPPIO RAGGIO • SPETTROFOTOMETRI A DOPPIA LUNGHEZZA d’ONDA

Spettrofotometro a singolo raggio Questo strumento lavora ad una singola lunghezza d’onda selezionata; è utilizzato normalmente per effettuare analisi che prevedono misure ad una sola lunghezza d’onda e per soluzioni con un solo analita.

Spettrofotometro a doppio raggio E’ presente un componente che sdoppia il raggio: è possibile avere il confronto simultaneo tra l’assorbimento della cuvetta contenente il campione e la cuvetta di riferimento. E’ possibile effettuare misure direttamente a qualsiasi l senza ripetere azzeramenti, e soprattutto registrare continuativamente lo spettro.

Spettrofotometro a doppia lunghezza d’onda

Monocromatori rifrazione Diffrazione

A= ε l c ΔA ε= coefficiente di estinzione molare ( M-1 cm-1) ΔC ε = ΔA / ΔC x l

Dosaggio enzimatico

Dosaggio enzimatico Ø Dosare la quantità di un substrato che prende parte ad una reazione catalizzata da un enzima. Ø Dosare l’attività di un enzima, cioè la velocità di una reazione catalizzata da un enzima.

Fattori che influenzano la velocità iniziale (Vo) Ø Ø Ø Concentrazione del substrato Concentrazione dell’enzima p. H Temperatura Presenza di attivatori o inibitori

Fattori che influenzano la velocità iniziale (Vo): concentrazione del substrato [S]

Fattori che influenzano la velocità iniziale (Vo): concentrazione dell’enzima [E]

Fattori che influenzano la velocità iniziale (Vo): p. H

Fattori che influenzano la velocità iniziale (Vo): Temperatura

Dosare l’attività di un enzima, cioè la velocità di una reazione catalizzata da un enzima.

Dosaggio attività enzimatica Dosaggio diretto:

Dosaggio accoppiato: MDH

…in laboratorio doserete l’attività incognita della GDH (EXP 1): KG + NADH + NH 4+ GDH Glu + NAD+

V = ΔC / Δt Legge di Lamber-Beer: A= ε l C Ricaviamo ΔC dall’eq. : ΔC= ΔA / ε l Sostituiamo ΔC nell’eq della velocità: V= ΔA / Δt ε l

…praticamente: Ai (ti=0) Af (tf) λ= 340 nm A (u. a) Ai ΔA Af ti Δt tf t (min. ) Ai (ti=0) Af (tf) v = ΔA / ε l Δt

…in laboratorio doserete la concentrazione incognita di KG (EXP 2): KG + NADH + NH 4+ GDH Glu + NAD+

…praticamente: λ= 340 nm Ai (ti=0) Af (tf) A (u. a) Ai ΔA Af ti tf Δt t (min. ) ΔC= ΔA / ε l

NADH ATP Oligomicina PEP LDH / PK Mg. Cl 2 λ= 340 nm T= 30° C 4 min

Dosaggio spettrofotometrico dei complessi della catena respiratoria mitocondriale Complesso I KCN/NADH Complesso IV Complesso II DCIP rot KCN Cit. C (ridotto) Co. Q 1 Succinato rot λ= 340 nm T= 30° C 4 min λ= 550 nm T= 38° C 4 min λ= 600 nm T= 30° C 6 min

APPLICAZIONI DELLA SPETTROFOTOMETRIA • analisi qualitativa: spettro d’assorbimento • analisi quantitativa diretta per sostanze che assorbono ad una data lunghezza d’onda, tipo le proteine il cui assorbimento a 280 nm si basa principalmente sul suo contenuto di tirosina e triptofano • analisi quantitativa indiretta tramite reazione colorimetrica; molte sostanze possono reagire con altre a dare un prodotto colorato. Si misura l’estinzione dei campioni rispetto a quella di un bianco che contiene tutti i reagenti tranne la sostanza da determinare • attività e cinetica enzimatica: si misura la velocità di comparsa o scomparsa di una sostanza con un picco caratteristico di assorbimento che partecipi come substrato o come prodotto alla reazione enzimatica in esame