Oleh Sumarno 1 KROMATOGRAFIPENDAHULUAN chromos zat warna dan

. Oleh Sumarno 1

KROMATOGRAFIPENDAHULUAN chromos (zat warna dan graphos (gambar) seorang botanis dari Rusia Tswett 2

Sebagai alat pemisah Pemisahan Dalam zat padat Pemisahan Dalam zat cair 3

PEMISAHAN YANG TERJADI v 1. Antara padat dan cair: Bahan cair Fase gerak (Mobile phase) Bahan Padat (Stationair phase) Fase diam 4

Sistem kromatografi fase gerak fase diam 5 dua fase yang tidak tercam pur selalu dalam satu sistem yang bercampur

Sifat kimia fisika Senyawa polar As. Benzoat Senyawa nonpolar -COOH Larut Na-Benzoat -COONa Kloroform 6 Air

Hukum distribusi Kadar senyawa yang larut dalam pelarut organik Kadar senyawa yang larut dalam pelarut air Berapi kali pengocokan agar asam Benzoat tersari dalam kloforom secara Sempurna (Kelarutan 1: 10) 7

PERBANDINGAN METODE PEMISAHAN Gambar. 8 Corong pemisah Kromatografi Distilasi bertingkat

§Agar senyawa dalam suatu campuran dapat terpisah, walaupun perbedaan sifat kimia dan fisika antara komponen dalam campuran hanya sedikit berbeda, dapat diusahakan dengan beberapa cara, dengan dasar 1. Dasar distribusi suatu senyawa (solut atau linrut), diantara kedua fase adalah hasil keseimbangan tenaga antara molekul linarut dan molekul masing-masing fase. Distribusi tersebut merupakan gambaran kekuatan tarikan atau penolakan molekul atau ion yang bersaing terhadap fase yang bersangkutan. 2. Tenaga tersebut karena sifatnya yang polar sehingga menimbulkan momen dipol secara tetap atau hanya memberi imbas, atau mereka terbagi karena ikatan London, atau kekuatan dispersi. § § § 9

3. Pada kromatografi penukar ion tenaga molekul linarut umumnya karena sifat ionik, tetapi dapat juga sifat polaritas dan nonpolaritasnya. Sifat polaritas nisbi pelarut dinyatakan dalam bilangan dielektrika (tetapan dielektrika). Tenaga potensial masing-masing molekul yang terpisah pada kolom kromatografi karena adanya gaya gravitasi, 4. Sedangkan pemisahan yang terjadi dengan distilasi fraksi karena perbedaan tekanan uap masing -masing senyawa, karena titik didih yang berbeda. Maka terdapat beberapa tipe atau mekanisme pemisahan akan dibahas tersendiri dalam paragraf berikutnnya. 10

B. PEMBAGIAN KROMATOGRAFI v Dalam bab ini kromatografi yang dibicarakan dibedakan menjadi kelompok yang berdasar atas: v 1. Menurut proses pemisahannya dibedakan menjadi: va. Kromatografi adsorbsi vb. Kromatografi partisi vc. Kromatografi pasangan ion vd. Kromatografi penukar ion ve. Kromatografi eksklusif vf. Kromatografi afinitas, 11

Pembagian berdasar alat v 2. Menurut alat yang digunakan terdiri dari 3 alat yang selalu dapat di kembangkan perleng kapannya ialah: va. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dapat juga dikenal dengan thin layer chromatography (TLC). Dan kromatografi Kertas vb. Kromatografi Gas, jenis kromatografi kolom yang menggunakan fase gerak gas. (GC) vc. Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT, dan berasal dari terjemahan High Perfomance Liquid Chromatograpfay atau HPLC. Kromatografi ini termasuk kromatografi kolom yang fese geraknya berupa cairan dialirkan berdasar kekuatan dari tekanan yang diberikan. 12

Menurut Willard et at, (1989), pembagian kromatografi dapat dibuat bagan sebagai berikut: Gas Cir padat GLC GSC 13

Keterngan : GLC = Gas Liquid Chromatography GSC = Gas Solid Chromatography IEC = Ion Exchange Chromatography EC=Eclusive Chromatography LLC=Liquid-Liquid Chromatography LSC= Liquid-Solid Chromatography BPC = Bonded Phase Chromatography PIC - Pair Ions Chromatography 14

Pembagian diatas berdasar jenis fase, ialah cair dan gas, sedangkan dalam pembagaian kedua seperti penukar ion dan eklusif serta pasangan ion hanya mengetengahkan salah satu fase diam, Memang Willard menerangkan bahwa kedua kromatografi penukar ion dan eklusif merupakan kromatografi yang berdasar pada interakasi antara linarut dan fase diam. Seperti pembagian kromatografi atas dasar pemisahaan, scbenamya kromatografi dibedakan menjadi 2 ialah: adsorbsi, dan partisi yang dapat terjadi baik dalam kromatografi gas maupun kromatografi cair. 15

Kromatografi eksklusif merupakan kroma tografi yang pemisahannya atas dasar ukuran molekul linarut, utamanya pada molekul yang besar, sehingga dinamakan pula kromatografi filtrasi. Pada kromatografi filtrasi dapat pula terjadi pada kromatogarfi gas tetapi dengan ukuran molekul yang kecil disebut moleculer shiever Sehingga terdapat teori pemisahan dalam kromatografi Teori tersebut perlu dibahas terpisah sesuai dengan topik dan aplikasinya. 16

C. TEORI PEMISAHAN Seperti telah dijelaskan bahwa kromatografi adalah alat pemisahan campuran senyawa kimia, karena itu perlu diketahui teori dan mekanisme dari berbagai pemisahan. 1. Pemisahan Adsorpsi v. Peristiwa adsorpsi oleh fase diam terhadap fase gerak dan linarut selalu terjadi kompetitif v. Kemampuan fase diam mengadsorpsi keduanya sangat tergantung pada topografi gugus aktif yang terdapat pada masing -masing komponen. v. Fase diam dari silica yang mempunyai gugas hidoksil dari silanol (Si-OH) dapat terjadi interaksi dengan gugus pada linarut maupun pada fase gerak. 17

Peristiwa adsorbsi umumnya terjadi pada kromatografi padat cair (liquid solid chromatography, atau LSC, terjadi pada KLT). Dapat pula terjadi pada Gas solid chromatography atau Kromatografi gas (KG) yang berinteraksi antara fase diam dan linarutnya. Fase gerak pada kromatografi gas, tidak mempunyai gugus aktif yang dapat berinteraksi dengan fase diam. Rumus kompetitif itu sebagai berikut: 18

Xm + n. Sads Xads + n. Sm (1. 1) ØXm dan Xads adalah linarut dalam fase gerak (m) dan fase diam (ads), sedangkan Sm dan Sads adalah fase gerak yang mengalami adsorpsi. ØBerdasar persamaan tersebut tempat linarut pada fase diam dapat digantikan oleh fase gerak atau sebaliknya. ØBila senyawa X mempunyai ikatan yang kuat terhadap penjerap (ads), maka X akan lama tertambat pada ads. Pada keadaan seimbang dirumuskan sebagai berikut: Ø (XAds)(Sm)n KD = (2. 1) (Xm)(Sads)n 19

Rumus Distribusi Rumus 2 dapat disederhanakan menjadi: KD =CS/CM (3. 1) q. CS menyatakan kadar linarut dalam fase diam (stationair phase), dan CM kadar linarut dalam fase gerak (mobile phase). q Persamaan diatas menunjukkan bahwa linarut X lebih banyak berinteraksi dengan fase diam karena indeknya lebih kecil dan jumlah dalam masing-masing fase juga sangat kecil. q. Dengan pedoman tersebut bcrarti kadar linarut dalam fase diam selalu lebih kecil dari kadar linarut dalam fase gerak. 20

Faktor yang berpengruh pada. Adsorpsi §umum seperti ini, sehingga harga K Dalam kromatografi selalu menggunakan pedoman selalu lebih kecil D dari 1, Tetapi mungkin dapat terjadi yang sebaliknya. Dasar tersebut yang menyebabkan terjadinya pemisahan. Adsorpsi linarut oleh fase diam sangat tergan-tung pada: a. Struktur kimia linarut atau adanya gugus aktif yang ada b. Ukuran partikel fase diam, makin kecil ukuran partikel fase diam makin luas permukaannya sehingga kontak dengan linarut makin luas. c. Kelarutan linarut dalam fase gerak, makin mudah larut linarut dalam fase gerak, linarut makin mudah lepas dari fase diam. § § 21

Interaksi Fase Diam dan Analit d. Kemampuan interaksi (isotermik) yang terjadi antara fasediam dan fase gerak. Contoh interaksi antara beberapa senyawa aromatik (analit ) dengan silica(fase diam) 22

v v 23

Ikatan hidrogen yang terbentuk dari para dihidroksi benzen paling kuat karena jarak gugus OH sama dengan jarak Si. OH. Bentuk ikatan tersebut menunjukka n bahwa para dihidroksi benzen membentuk ikatan pada ke dua sisi dengan silanol. Hal tersebut juga terjadi pada gugus yang lain seperti nitro, amina, karena gugus yang terdapat pada senyawa tersebut sebagai pemberi atau penerima elekron maupun proton ( atom N, 0, P dan S) maka kejadiannya dapat dilihat pada gambar slide 25. Puncak hasil analisis dengan HPLC atau bercak yang terjadi pada analisis dengan KLT untuk 24 dihidroksi benzen sangat berbeda dengan yang

Contoh Puncak dan bercak. Campuran sebelum elusi 25

Keterangan Puncak pada KCKT p-dihidroksi benzen paling lama tertahan dalam kolom dengan fase diam silica gel. Karena iktannya paling kuat. Bercak pada KLT p-dihidroksi benzin paling pendek migrasinya, karena ikatan dengan fase diam silica paling kuat. v. Makin dekat gugus hidroksil, ialah meta dihidroksi dan o – dihidroksi benzen paling mudah terelusi oleh pelarut, tetap ikatan adsorbsinya dengan silika makin lemah, 26

Penggolongan tipe adsorbsi isotermik Peristiwa adsorbsi isotermik dapat digolongkan dalam beberapa tipe. a. Tipe konkap, terjadi bila mula-mula linarut tidak kuat interaksinya. tetapi kemudian menjadi lebih kuat sehingga terikat lama pada fase diam. berarti K < 1 b. Tipe normal (linier), ikatan yang terjadi pada sctiap saat panggah atau tetap. Sehingga berupa garis lurus dan K = 1. c. Tipe konvek, adsorpsi mula-mula terikat dengan kuat oleh fese diam, tetapi makin lama makin lemah sehingga bentuk kurvanya menjadi konvek atau harga K>1 Puncak berckor Tipe a dan b tersebut yang sering menyebabkan terjadinya pelebaran puncak lihat gambar 3. 2 27

Cntoh gambar adsorbsi isotermik Gambar: 28

a. Jenis fase diam Fase diam untuk kromatografi adsorbsi yang paling banyak digunakan adalah silica gel, hampir semua bahan kimia dapat dipisahkan secara kromatografi menggunakan fase diam silica gel. Partikel fase diam mempunyai bentuk dan ukuran yang berbeda. Ukuran makin kecil akan makin memperluas pcrmukaan fase diam, dan memperluas pula gugus aktif dan fase diam yang aktif berhubungan dengan linarut Bentuk dengan pori yang dalam, bila pori tersebut sangat banyak akan menaikkan harga K, yang jauh lebih besar dari 1 dan menimbulkan garis kurva adsorbsi isotermik yang konkaf 29

Makin dangkal pori yang ada, makin efisien untuk pemisahan. dan kromatografi model sekarang digunakan yang paling efisien. Dianjurkan untuk memilih fase diam dengan pedoman sebagai berikut: 1). Fase diam yang bentuk pelikuler (pori yang dalam) akan menurunkan efisiensi, tetapi menaikkan kapasitasnya. 2). Bentuk pelikuler tak berporus umumnya dibuat packing dengan cara kering 30

Ø 3/. Bentuk mikroporus, dikepak secara basah (adonan atau slurry, permukaan jadi luas menambah harga K Ø 4/. Bila pemisahan antara linarut sukar. sebaiknya menggunakan mikroporus, karena efisiensinya makin tinggi, luas permukaan partikel makin besar, sehingga kontak dengan linarut makin banyak (K menjadi besar). ØKejadian tersebut akan menaikkan sifat selektivitas t. R 2 fase diam terhadap linarut, t. R 1 dan kapasitas fase diam akan menjadi lebih besar. tm 02 4 6 8 10 Waktu tambat daiam memt 31 Gambar 4. 1 Dua puncak dari senyawa alkena yang isomer sampel 1 dan 2 untuk melewati kolom. Makin besar selisih t. R 2 dengan t. R 1, kedua puncak akan makin jelas pemisahannya. Kejadian sepertt itu adalah tujuan utama untuk pemisahan sekaligus analisis yang menggunakan kromatografi,

Perbedaan porositas Ø Porositas merupakan rasio antara volume total fase diam dengan volume kolom. Untuk pengepakan yang rapat porositas antara 0, 35 - 0, 45, sedang porositas yang kurang rapat antara 0, 70 - 0, 90. Ø Makin besar harga rasio tersebut tempat kosong dalam kolom akan makin besar sebingga akan menurunkan kapasitas dan efisiensi. Ø Tetapi pada kolom kapiler terutama pada kromatografi gas cair, harga porositas tidak ada, karena fase diam menempel pada dinding kapiler bagiao dalam. 32

Rumus porositas = Kecepatan rata-rata rase gerak dalam kolom dapat dinyatakan dengan yang merupakan kecepatan linier, yang harganya dirumuskan: Vt (Voltotal) = (6. 1) V d (Vol. fase diam) Volume fase diam= L/tm (7. 1) Gambar 4 menunjukkan beberapa parameter, tm waktu yang diperlukan fase gerak 33

Tabel I. I Beberapa nama adsorben/penjerap dan ukurannya (Johson dan Stevenson 1979) Tipe Nama Ukuran(nm) Sifat Luas m 2 g Silica Pellosil 37 -50 Asam- 1 -7 dan 111 aktif Corasil 37 -44 lemah HS-4 (HS dan HC HC-8 Perrisorb A 30 -40 14, 12, Vydac 30 -44 34 Alumin Pellumina a HS dan HC Pellidon Lain. Perrisorb PA lain Diatomeae Lempung Celite 37 -44 45 30 -44 Basa lemah non polar HS-4 & HC-8 1 0, 5

Keterangan v Dalam memilih fase diam, yang perlu diperhatikan kepentingan dan jenis fase diam serta asal fase diam yang digunakan. v. Corasil misalnya ukuran partikelnya sangat jauh rcntangannya sehingga luas permukaan persatuan berat juga bervariasi, dan akan menurunkan selektivitas dan kapasitas. v. Floresil yang jarang digunakan karena asam kuat, digunakan bila bahan lain tidak mampu memisahkan senyawa yang dikehendaki. Pada kromatografi partisi, terdapat bilangan partisi atau tetapan partisi dengan inial k' (perbandingan kadar linarut dalam fase diam dibanding dengan kadar linarut dalam fase gerak). 35

2. Partisi Pemisahan cara partisi sangat erat kaitannya dengan kelarutan senyawa ke dalam pelarut. Dalam kromatografi didasarkan pada kelarutan linarut dalam fase diam maupun fase cair, maka terdapat istilah koefisien partisi, yang peristiwanya akan mengembang menjadi koefisen distribusi yang umumnnya berlaku pada kromatografi. Koefisien partisi dapat dinyatakan sebagai perbandingan kadar(kelarutan) linarut dalam fase diam dengan kadar(kelarutan) linarut dalam fase gerak. 36

Sedangkan secara umum adalah perbandingan kelarutan senyawa dalam oktanol diban-ding kelarutannya dalam air, (lihat rumus 10. 1) Sifat linarut dalam kromatografi dapat digambarkan dalam berbagai cara, pada kromatografi kolom dikenal dengan volume tambat atau VR. VR (sesuai dengan jumlah volume fase gerak yang digunakan untuk membawa satu linarut keluar dari kolom). Tetapi bila dinyatakan dengan t. R (waktu tambat) menyatakan waktu yang diperlukan fase gerak membawa linarut keluar dari kolom. Kolom 37 KLT

Sedangkan waktu yang diperlukan untuk membawa linarut bergerak dari satu titik ke titik yang lain dalam KLT atau elektroforese disebut Rf. Satuan ini merupakan perbandingan jarak yang ditempuh linarut dengan jarak yang ditempuh pelarut (fase gerak) dalam waktu yang sama Jarak migrasi sampel Rf = Jarak migrasi pelarut Pada kromatografi partisi, terdapat bilangan partisi atau tetapan partisi dengan inial k' (perbandingan kadar linarut dalam fase diam dibanding dengan kadar linarut dalam fase gerak). Rumusnya adalah: seperti k’= Cs. Vs/ (Cm. Vm) 38

Teori pemisahan v Pemisahan yang terjadi dalam sistem selalu mengalami keseimbangan yang dinamis, baik pemisahan tersebut karena peristiwa adsorbsi partisi, penukaran ion, permiasi, maupun cara afinitas. 39

a. Retensi (Tambat) Ø Sifat tambat suatu linarut menggambarkan jenis distribusi linarut diantara fase gerak dan fase diam. Ø Slide 35 menunjukkan pemisahan dua senyawa dihidroksi benzen. Ø Volume dari fase gerak yang diperlukan untuk membawa linarut dari permulaan sampai akir elusi (sampai pada detektor, untuk kromatografi gas dan kromatografi cair) lewat fase diam baik dalam kolom atau lempeng tipis dinamakan volume tambat. Ø Retensi ini dinyatakan sebagai VR (volume tambat) atau t. R (waktu tambat), kedua istilah itu berlaku untuk kromatografi gas dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). 40

Contoh: 41

Sedangkan Rf (=retenstion faktor atau rasio waktu tambat dari pelarut dan linarut), juga disebut retardation factor yang umumnnya digunakn untuk KLT dan kromatografi kertas: Maka dalam kromatografi kolom dirumuskan sebagai berikut : VR = t. R. Ft (4. 1) Ft - kecepatan alir rase gerak tiap satuan waktu dan Ft dapat dihitung atas dasar: (dc)2 L Vcol( tot) Ft=—— X( tot)X ——= ———— (5. 1) 4 tm d = garis tengah kolom dalam keadaan kosong ( = porositas, L/tm = kecepatan rata-rata L = panjang kolom. V= volume kolom seluruhnya 42

Arti porositas 43

Porositas merupakan rasio antara volume total fase diam dengan volume kolom. Untuk pengepakan yang rapat porositas antara 0, 35 - 0, 45, sedang porositas yang kurang rapat antara 0, 70 - 0, 90. Makin besar harga rasio tersebut tempat kosong dalam kolom akan makin besar sehingga akan menurunkan kapasitas dan efisiensi. Tetapi pada kolom kapiler terutama pada kromatografi gas cair, harga porositas tidak ada, karena fase diam menempel pada dinding kapiler bagian dalam. 44

Kecepatan rata-rata fase gerak dalam kolom dapat dinyatakan sama dengan kecepatan linier, yang harganya dirumuskan: Vt (Voltotal) = (6. 1) V d (Vol. fase diam) µ=L/tm (7. 1) Gambar slide 32 menunjukkan beberapa parameter, tm waktu yang diperlukan fase gerak untuk keluar dari kolom. Sedangkan t. R 1 dan t. R 2 menyatakan waktu yang diperlukan sampel 1 dan 2 untuk melewati kolom. Makin besar selisih t. R 2 dengan t. R 2 , kedua puncak akan makin jelas pemisahannya. 45

Kejadian seperti itu adalah tujuan utama untuk pemisahan sekaligus analisis yang menggunakan kromatografi, Pelarut atau fase gerak yang tidak ditahan oleh fase diam dan dinyatakan dengan waktu tm , pada waktu itu tidak ada linarut yang telah terdusi sehingga Vm = Vo, harga ini disebut juga dead space ruang mati yang tak berfungsi, maka bila dihitung harga sesungguhnya: VR -Vo -VR 'atau t. R=tm-t. R (8. 1) Dalam kromatografi lapis tipis parameter seperti tersebut tidak diketemukan, sehingga hanya berlaku bagi kromatograti gas, kromatografi kolom, dan KCKT 46

v. Pada kromatografi gas fase gerak yang berupa gas harus dinyatakan tekanan dan suhunya, karena kenyataannya kecepatan alir gas pada pennulaan kolom atau inlet lebih besar dari kecepatan pada akir kolom atau outlet. v. Maka dari itu kecepatan tersebut secara bertahap mengalami penurunan yang digunakan faktor: sebagai koreksi: 3{(Pt/P 0 )2 -1} j = (9 -1) 2{(Pt/P 0)3 -l} v P, adalah tekanan pada suhu t atau inlet pada kolom, dan P 0 tckanan pada suhu (kamar), atau outlet. 47

b. Tetapan Partisi Ø Bila linarut dimasukkan dalam sistem kroma tografi, maka linarut akan segera menebar kebagian-bagian fase diam maupun fase gerak. Ø Pada saat fase gerak berhenti. linarut akan terbagi kedalam dua fase yang mempunyai perbandingan tertentu, bandingkan dengan slide 2 a dan 2 b yang besamya diberi istilah tetapan partisi termodinamik, dengan rumus: Ø K = Cs /Cm (10. 1) Ø Cs merupakan kadar linarut dalam fase diam dan Cm kadar linarut dalam fase gerak. Harga ini akan tergantung kekuatan interaksi antara linarut dengan fase diam dan linarut dengan fase gerak 48

§. Untuk puncak yang semitris maka linarut akan § § 49 terbagi secara teratur ke dalam VR, atau terelusi dan sebagian tersisa dalam fase diam karena itu dirumuskan: Cm = Vffl. Cm + Vs. Cs Atau: (11. 1) VR = Vm Cm / Cm + Vs. Cs/ Cm menjadi VR = Vm + K. Vs atau. VR-Vm=KVs (12. 1) Dalam persamaan ini terlihat bahwa volume retensi (VR) sangat bergantung pada ruang kosong (Vm), tetapan partisi (K), dan kemampuan fase diam melarutkan linarut (Vs). Bila persamaan tersebut diterapkan pada peristiwa adsorbsi misalnya maka Vs dapat diganti As

3. Rasio Partisi Istilah diatas lebih dikenal dengan nama kapsitas atau 50 k 1, bilangan ini menyatakan kuantitas rasio kemam puan fase menampung linarut yang sangat penting dalam kromatografi kolom Sesuai dengan definisi maka harga tersebut merupa kan perbandingan jumlah molekul linarut dalam fase diam dengan jumlah molekul linarut dalam fase gerak, yang dirumuskan: k' = (Cs Vs)/(Cm. Vin) (13. 1) Simbul perbandingan volume V/Vm dinyatakan dengan , sehingga k’=K/ (14. 1)

Bila suatu linarut tidak mengalami tambatan (penahanan dalam fase diam maka tak ada tambahan waktu, dan k'=0, karena itu k' dapat pula dirumuskan sebagi berikut: k’=(t. R-tm)/tm (15. 1) k’= t. R/ tm – tm/tm t. R/tm = k’ +1 atau t. R = tm(k’ +1) atau: t. R = L/u(l+k') lihat rumus 7 (16. 1) Rumus 11 menjadi jelas bahwa waktu tambat sangat erat kaitannya dengan kecepatan gerak elusi ( ), panjang kolom (L), dan kapasitas fese k’. 51

4. Tambat Relatif (Snyder & Kirk. Jand, 1979) Tambat relatif merupakan rasio tambat antara dua linarut yang berbeda setelah dielusi atau dapat dinyatakan dalam beberapa paramter: k’ 2 K 2 vr. 2 t'R. 2 = = = = (17. 1) k'1 Kt VR 1 t. R-1 Makin besar harga akan makin besar selisih waktu tambat linarut 2 - (dikurangi) waktu tambat linarut 1. Berarti kedua puncak linarut tcrsebut dapat terpisah dengan baik (Slide 2). Keadaan tersebut menggambarkan kemampuan fase membedakan linarut 1 dan linarut 2. 52

Maka dikenal sebagai harga selektivitasnya fase. Atau Selektivitas ini merupakan faktor yang berpengaruh pada daya pisah romatografi. Keadaan tersebut menggambarkan kemampuan fase membedakan linarut 1 dan linarut 2. 53

5. Efisiensi Kolom Efisiensi kolom sangat dipengruhi oleh berbagai faktor, terutama koefisien distribusi yang ajek dan tidak dipengaruhi oleh kadar linarut, Dengan demikian hasil elusi bila digambarkan dalam kurva akan didapat puncak yang semitris ( gambar 5 a). Karena elusi fase gerak terhadap linarut pada mulanya hanya sedikit membawa linarut, yang makin lama makin besar setelah mencapai maksimun akan turun lagi sampai fase gerak bebas linarut. Bentuk puncak tergantung akan hubungan linarut dan fase gerak, kalau linarut mudah terbawa fase gerak maka didapat puncak yang ramping. 54

Sebaliknya bila linarut lebih banyak terikat oleh fase diam akan didapat puncak yang melebar. Pola tersebut (gambar 5) adalah puncak yang normal. Pada gambar 5 a garis yang ditarik dari puncak sampai memotong dasar pada titik 0, kekanan sampai angka +3, sama besarnya kekiri sampai angka -3, mempunyai harga sama atau semitris. Bandingkan dengan gambar 5 b. Dari data parameter tersebut dapat didiskusikan berbagai hal. Seperti Efisiensi Kolom, lempeng teoritis, puncak semitris dan tidak semitris, (pelebaran puncak) dengan segala faktornya. 55

Lanjutan Efisiensi Kolom v a. Jumlah lempeng dan tinggi lempeng teoritis v. Dalam kromatografi, ciri yang penting adalah efisinsinya yang dapat dihitung tetapi tanpa dimensi. v. Parameter tersebut dinamakan lempeng efektif atau effective plates number atau - Neff v. Bilangan tersebut menyatakan: jumlah peristiwa partisi yang dialami oleh linarut pada setiap saat yang dibawa fase gerak dari masuknya linarut atau inlet, sampai keluar kolom atau outlet. v. Jumlah lempeng efektif tersebut dirumuskan sebagai berikut: 56

L= panjang kolom, H= (HETP), atau High Efficiency Theoritical Plates, t. R, waktu retensi. = lebar alas dari puncak, ( menit atau detik) Karena lebar dasar Wb, sama dengan 4 (gambar 2), maka rumus 18 menjadi Pengukuran lebar puncak pada setengah tinggi bagi puncak yang tidak semetris akan mengalami kesulitan. 57

Pelebaran puncak Sebab sering terjadinya ekor atau tailing dan puncak pendahulu yang dinamakan leading atau fronting, akan sulit menggunakan garis dasarnya. Tinggi lempeng yang dinyatakan dengan H sebenarnya dari istilah high efficiency of theoritical plates = HETP. Harganya selalu lebih kecil dari pada 1, karena sebenarnya merupakan panjang kolom L dibagi dengan Jumlah lempeng teoritis H = L/Neff (20. 1) 58

59