Genov exprese II Posttranslan osud protein Protein folding

Genová exprese II: Posttranslační osud proteinů Protein folding Protein sorting Protein processing (modifikace) Regulace proteinové aktivity Degradace, turnover

Genová exprese = syntéza funkčního proteinu podle sekvence DNA

Co zaručuje funkčnost proteinu? 1) správná konformace (folding) 2) asociace všech podjednotek (kvarterní struktura) 3) správná lokalizace v buňce (sorting) 4) posttranslační modifikace (irreverzibilní ) 5) vazba kofaktorů (koenzymy) 6) regulace aktivity (reverzibilní modifikace) Degradace proteinů: 1) Špatně složené, poškozené proteiny 2) Reakce na podněty (regulace) 3) Běžný obrat (turnover)

4. 1 Protein folding Interakce postranních řetězců AMK, disulfidické můstky (ER) Motivy (α helix, β list, smyčky) x domény Nesbalené proteiny: hydrofobní AMK na povrchu Probíhá i kotranslačně Chaperony (a chaperoniny) - asistující proteiny

Chaperony • Hsp 70 family (monomer) • Hsp 60 family (barel) Spotřeba ATP Hsp = heat shock protein

*Amyloidy (Priony) • • Špatně složené proteiny (nezničitelné) Uvádějí další proteiny do špatné konformace Bovine spongiform encephalopathy (BSE) Prusiner - NC 1997

4. 2 Protein sorting • Cílování do správného kompartmentu: A) Transmembránový transport (ER, mtch, plastidy, peroxizómy) B) Vesikulární transport (povrch, Golgi, lysozómy, sekrece) C) Gated transport (jádro) • Membránové proteiny (přes ER) • Signální sekvence

Zásadní rozcestí

První rozcestí: Translace Ribozómy: 1) volné (cca 50 %) 2) vázané (drsné ER) (cca 50 %) N koncová signální sekvence nascentního proteinu

4. 2. 1 Endoplazmatické retikulum • • • Kotranslační transport "Signal recognition particle" se váže na signální sekvenci Signál → SRP receptor → translokátor Translace se zastaví, dokud není komplex naveden na receptor Nascentní protein se protlačuje do lumen ER, odštěpení SS VIDEO

Membránové proteiny • Plasmatická membrána = kotevní + stop transfer sekvence • Membrána ER, Golgi, lysozómů, endosomů VIDEO

Sekreční dráha (Váčky) Směry: ER → Golgi → Lysozómy Golgi → Plasmatická membrána (sekrece) Golgi → ER (retrográdní dráha) Plasmatická membrána → Endozóm (Endocytóza) Váčky: plášťový protein, vesicle a target SNARE, další enzymy COPI, COPII, clathrin, calveolin VIDEO

VIDEO • • • Clathrinové váčky Receptorové proteiny Clathrinový obal: triskelion Dynamin - odškrcení SNARE (soluble NSF attachment receptor), t-S. , v-S. Rab pomáhá fúzi (GTP) NSF - protein rozplétá SNARE komplexy (ATP) VIDEO

Retence v ER • C koncová sekvence: KDEL (lys, asp, glu, leu) • Návrat do ER z Golgi • KDEL - receptor - návrat (retrográdní dráha) • Role p. H

Sekrece • Opačný proces než endocytóza (fúze membrán) 1) Konstitutivní x 2) Regulovaná (signálem řízená) Transcytóza (endo + exocytóza, polarizované buňky) Ig. G (mateřské mléko)

Lysozómy • Golgi → Lysozóm (Clathrinové váčky) • Fosforylace manózy (man-6 -P), receptor, transport, disociace • Hydrolytické enzymy

Endocytóza • Pohlcování látek z vnějšího prostředí • Clathrinové (a calveolinové) váčky • Receptor - Clathrin - Odškrcení váčku • Early endosome late endosome (p. H 5) →lysozóm • Uvolní se kargo, regenerace receptoru • Častý vstup virů do buňky Savci: VIDEO Souvislosti: Transport látek přes membrány

4. 2. 2 Mitochondrie a chloroplasty • • • Přestože se jedná o SAO, většina proteinů kódovaná v jádře Připomíná transport do ER, ale posttranslačně N koncová signální sekvence Transport přes translokátorové komplexy Další signály rozhodující o sublokalizaci Protein je nesložený

Mitochondrie Klasická dráha: • Rozpoznání signálu • Receptor, TIM a TOM komplexy • Matrix: Odštěpení SS, folding Energie: ATP (Hsp 70), protonový gradient VIDEO

Mitochondrie II • Sublokalizace: • 2 cesty do membrány • Intermembránový prostor

Plastidy • Analogicky k mitochondriím • Navíc subkompartment (lumen thylakoidů) - 2 SS

Peroxizómy C koncová sekvence (SKL) (i internální sekvence) Protein v nativním stavu Klasický postup: signál - s. receptor - m. receptor - transport

4. 2. 3 Jádro • Jaderný pór: importní/exportní receptor (gated) do 5 k. Da - volná difuze 17 k. Da - malá překážka od 60 k. Da - nemohou projít

Jádro II Ran - regulace (Ran-GTP v jádře, Ran-GDP v cytosolu) Importin (importní receptor) (import proteinů) Exportin (exportní receptor) (export m. RNA, ribozómů, proteinů)

4. 3 Protein processing A) B) C) D) Chemické modifikace (připojování skupin) Tvorba disulfidických (cysteinových) můstků Proteolytický sestřih (štěpení) Membránové kotvy (GPI, farnesylace, myristylace) Úpravy přímo ovlivňují: konformaci (folding), chemické a fyzikální vlastnosti Biologická role: katalytická aktivita, molekulární interakce, lokalizace

Chemické modifikace Irreverzibilní (maturace) x Reverzibilní (regulace) 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) Glykosylace (Asn, Thr, Ser) Tvorba disulfidických můstků Acetylace (N konec) Methylace (His) Fosforylace (Tyr, Ser, Thr, His) Karboxylace (Glu, Asp) Hydroxylace (Pro, His) Alkylace Souvislosti: Proteinové regulace

Glykosylace (cukerné řetězce) Glykosyl transferázy, membránové proteiny (povrch) O-glykosylace (Thr, Ser) - Golgi (méně známá): oligosacharidy, připojování monosacharidů N-glykosylace (Asn) - ER (kotranslačně) + Golgi: větší řetězce, připojování větších jednotek N-G: pouze eukaryota

Disulfidické můstky • • Vazba S-S cysteinů na různých místech řetězce Probíhá pouze v ER (vhodné redoxní prostředí) + bakterie PDI (protein disulfid izomeráza): korekce S-S můstků Redukční prostředí - rozpad S-S

Membránové kotvy • GPI (Glykosyl fosfatidyl inositolová) kotva (C konec) • Kotvení v membráně (směr do lumen ER, tj. ven z buňky) x hydrofóbní ocásky kotvící protein směřující do cytosolu Cytosol: Myristylace Farnesylace Palmitylace

Sestřih proteinu • Štěpení peptidového řetězce • Proteázy (trypsin) • Bakterie a nižší E. : autokatalytické štěpení

4. 4 Regulace proteinů Reverzibilní změny ovlivňující aktivity proteinů: 1) Fosforylace - vazba [-] skupiny, změna vlastností 2) Vazba GTP/GDP 3) Allosterická regulace Souvislosti: Regulace genové exprese Signalizace

Fosforylace proteinů Ser/Thr (nejčastější), Tyr (signalizace), His (bakterie) Protein kinázy (ATP→ADP) a protein fosfatázy Fosforylace aktivuje nebo deaktivuje protein

GTP/GDP vazebné proteiny Již zmíněné příklady: IF-2, EF-Tu, RF-3, Rab, NSF, Ran Vazba GTP/GDP mění vlastnosti GAP - GTPase activating protein GEF - GTP/GDP exchange factor VIDEO

Allosterická regulace Vazba inhibitoru/aktivátor - vliv na katalytickou aktivitu Vazba molekuly - změna kvarterní struktury Pozitivní regulace Negativní regulace Protein kináza A (c. AMP dependentní)

4. 5 Degradace proteinů Důvody: 1) běžný obrat (turnover) 2) nepotřebný protein (regulace) 3) poškozený protein (špatně složený) Proteazóm: degradace proteinů Polyubikvitinylace: připojení malých peptidů, degradační signál Probíhá v cytoplazmě: transport proteinů z ER pro degradaci VIDEO Souvislosti: Regulace genové exprese

Maturace a osud proteinu: shrnutí Peptidový řetězec je dále upravován (SS můstky, fční skupiny. . . ) Složení do správné konformace je řízeno chaperony Protein (gen) obsahuje informaci o cílové lokalizaci (signální s. ) Část proteinů (cca 50 %) je kotranslačně transportována do ER Vesikulární transport: váčky pohybující se mezi kompartmenty Sekreční dráha: ER→ Golgi → plasmatická membrána Nejčastějšími úpravami membránových proteinů je glykosylace a vazba hydrofóbní kotvy (do membrány) Regulace proteinové aktivity (fosforylace, GTP/GDP vazba) Ubikvitin dependentní degradace v proteazómech