3 Genov exprese I Transkripce RNA processing Translace

3. Genová exprese I Transkripce RNA processing Translace

Genová exprese • Definice (pro naše účely): Syntéza funkčního proteinu (nebo RNA) podle informace v DNA • Princip: Sekvence DNA → Primární struktura proteinu → Terciální struktura proteinu → Funkce • Proces: 1. Transkripce (DNA → RNA) 2. Úprava RNA (zejména u eukaryot, celá řada procesů) 3. Translace (RNA → protein) 4. Folding, sorting, posttranslační úpravy

Fáze genové exprese Genová exprese u eukaryot (transkripce - translace) Různé geny jsou exprimovány s různou intenzitou (v závislosti na potřebách buňky)

3. 1 Transkripce Syntéza ss. RNA podle předlohy (DNA) Princip komplementarity bazí (A=U, T=A, C≡G, G≡C) 5´ → 3´ směr Je asymetrická (pouze [-] vlákno DNA) Není třeba primer Lokalizace: Eukaryota: jádro, semiautonomní organely Prokaryota: cytoplazma

Druhy RNA Kódující x nekódující (funkční, strukturní) Ribozym - katalytická RNA Hypotéza RNA světa

Enzymatický aparát RNA polymeráza (více podjednotek) Transkripční faktory Promotor: sekvence DNA iniciující transkripci Terminátor: sekvence DNA ukončující transkripci Promotor a terminátor vymezují transkripční jednotku RNA polymeráza: Rychlost E. 20 nt/s P. 50 nt/s Chyby 10 -5

RNA polymeráza (cyklus) 1. Vazba RNA pol. 2. Otevření DNA dvojšroubovice (vyžaduje/nevyžaduje ATP) 3. Abortivní iniciace (syntéza krátkých RNA molekul) 4. Promoter clearance – počátek syntézy transkriptu, elongace 5. Terminace transkripce, odpadnutí RNA pol. VIDEO

Produkt transkripce: RNA 1. Funkční RNA: r. RNA (80 %), t. RNA (15 %), sn. RNA, sno. RNA, mi. RNA, 7 SL RNA atp. (ribozymy) (stabilní) 2. m. RNA (4 %): Eukaryota: 5´ nepřekládaná oblast Překládaná oblast = ORF (1 protein) 3´ nepřekládaná oblast Úprava konců (5´ čepička, 3´ ocásek) ½-čas života 30 min až 20 hodin Prokaryota: proteinů Polycistronní transkript (operon) 1 molekula m. RNA kóduje více ½-čas života 2 až 3 min

3. 1. 1 Bakteriální transkripce • Jeden typ RNA polymerázy • σ faktor (σ70 + stresové σ ) : iniciace, vazba RNA pol. • -35 a -10 konsensus (-10 = Pribnowovův/TATA box) TTGACA TATAAT

Bakteriální transkripce II Terminace 1) ρ nezávislá Vlásenka (GC) (invertovaná repetice) Na konci oligo(U) – uvolnění RNA 2) ρ (Rho) závislá Hexamer ρ, vytáhne transkript Signální C bohatá sekvence Spotřeba ATP Transkripce a translace probíhají současně

3. 1. 2 Eukaryotická iniciace transkripce 3 druhy polymeráz (podle typu RNA) RNA polymeráza II – syntéza m. RNA Transkripce a translace prostorově a časově odděleny Transkripční faktory: obecné (GTFs), speciální DNA vazebná, aktivační a regulační doména GTFs nasedají v definovaném sledu (D, A, B, E, H, F + RNA pol. ) Fosforylace CTD (carboxy terminal domain) TFIIH – helikázová aktivita (spotřeba ATP)

Eukaryotická iniciace transkripce II In vivo jsou pro iniciaci důležité další proteiny: A) Chromatin: Histon acetyláza = modifikace histonů Chromatin remodeling complex = uvolnění DNA z chromatinu B) Vzdálené elementy: Enhancer = vzdálená aktivační sekvence DNA, interakce s TF, HAT Mediátor = proteinový komplex

3. 2 RNA processing U m. RNA pouze u eukaryot (sestřih i Archea) Kontranskripčně, kontrola kvality (pro translaci) 1. "Capping" 2. Polyadenylace 3. Sestřih (splicing) 4. Transport z jádra

Čepička, poly(A) ocásek Cap = 7 -methylguanosin Poly(A) ocásek - terminace transkripce Funkce = značka (vše je v pořádku, kontrola kvality): Transport, ochrana proti degradaci, translace Primární transkript (hn. RNA) - komplex s proteiny a) c) b) d)

Sestřih U kvasinek vzácný, u savců velmi častý Intron - úsek, který se vyštěpí (degradace), není nikdy překládán Exon - úsek, který jde z jádra (může a nemusí být překládán - viz UTR) Introny jsou vymezeny určitou sekvencí (GU. . . AG) Více mechanismů (zde uveden nejrozšířenější) 1. Lariátová struktura (2´ transesterifikační reakce, branching point A, 5´ - 2´ vazba) 2. Spliceosome: ribozymy (sn. RNA) (existuje i self-splicing) Alternativní sestřih: více variant sestřihu (i m. RNA, proteinu) Funkce: nejasná (alternativní sestřih) evoluce nových genů

Alternativní splicing VIDEO Spliceosome

Transport m. RNA z jádra • • Export jaderným pórem Mnoho m. RNA vazebných proteinů zůstává v jádře Role čepičky (i ocásku) Musí být správně sestřižena - proteiny vážící exon/exon hranice

RNA editing Posttranskripční úprava sekvence m. RNA (změna informace) Není příliš rozšířený (ale i u nepříbuzných druhů) Člověk: deaminace (C→U, A→I), substituce Trypanosoma - mitochondrie: g. RNA - inzerce, delece Význam: nejasný (evoluční oportunismus), alternativní editing Lidský apolipoprotein B N-koncová doména Trypanosoma (kinetoplast) inzerce, delece U

Úprava funkčních RNA: r. RNA (E: 18 S, 5. 8 S, 28 S, 5 S x B: 16 S, 5 S, 23 S): více (i u eukaryot), sestřih (i u prokaryot) sno. RNA, RNáza P atp. (ribozymy i proteiny) modifikace (pseudouridin), 2´ O methylace jadérko (struktura v jádře) Tvorba malé i velké ribozomální podjednotky export z jádra

Úprava funkčních RNA: t. RNA: Sestřih (ne vždy) - štěpení + ligace (odlišný od m. RNA!) Modifikace konce (CCA), modifikace bazí RNáza P, nukleázy, ligázy Jadérko

• • 1) 2) • 3. 3 Translace Syntéza proteinu (překlad informace m. RNA → protein) Aparát (složitý): t. RNA, r. RNA (ribozómy), celá řada enzymů Mimoribozomální fáze (aktivace t. RNA - vazba AMK) VIDEO Ribozomální fáze (elongace proteinového řetězce) Cytoplazma, SA organely Čtecí rámec Genetický kód: Tripletový (triplet = kodón) Degenerovaný (43 = 64, kódovaných aminokyselin je 20 + STOP) Univerzální (+/-, známé odchylky: mitochondrie, C. albicans)

Mimoribozomální fáze translace Vazba t. RNA a AMK (aktivace t. RNA) (3´ OH nebo 2´ OH) Aminoacyl-t. RNA syntetáza (pro každou AMK min jedna) Opravná (proofreadingová) aktivita (celk. chybovost 10 -5) Energie: 2 makroergní vazby (ATP→AMP ≡ 2 ATP → 2 ADP)

Ribozóm Malá a velká podjednotka Komplex r. RNA (2/3) a proteinů (1/3) (katalytická funkce r. RNA) Důležitá místa na ribozómu: m. RNA vazebné místo Aminoacylové místo Peptidylové místo Exit VIDEO

Ribozomální fáze translace Princip: t. RNA (antikodón) páruje s kodónem Vznik peptidické vazby Fáze: Iniciace (rozdíl bakterie x eukaryota) Elongace Terminace Směr: N → C konec Elongace

Bakteriální iniciace translace • RNA nemá upravené konce, polycistronní 1. Sekvence Shine-Dalgarno (-10 b) na m. RNA Vazba 30 S podjednotky (komplementární k 16 S r. RNA) 2. Iniciátorová t. RNA (N-formylmethionin) - vazba na AUG kodón 3. Vazba 50 S podjednotky Iniciační faktory (IF-1, 2, 3), GTP Ribozóm může nasednout na více místech Signál pro iniciaci transkripce

Eukaryotická iniciace translace • m. RNA má upravené konce, monocistronní 1) 40 S podjednotka váže iniciátorovou t. RNA (met) 2) Vazba 40 S na 5´ konec m. RNA 3) 40 S hledá první START kodón (AUG) 4) Vazba 60 S podjednotky Iniciační faktory (e. IF-2, 4 E, 4 G), GTP, ATP *IRES Internal Ribosomal Entry Site Alternativní způsob iniciace

Translace: Elongace (B. i E. ) VIDEO Tvorba peptidické vazby, prodlužování řetězce VIDEO Spotřeba GTP (posun ribozómu) Elongační faktory: EF-Tu (1α) - Přináší t. RNAn GTP→GDP - disociace EF-Ts (1βγ) - Nabíjí EF-TU (GDP→GTP) EF-G (2) - vazba do A místa: t. RNAn jde do P místa, t. RNAn-1 exit Polyribozóm

Translace: Terminace Terminační faktory (Release factors): RF 1, 2, 3 (e. RF 1, 3) (GTP) Váží se na STOP kodóny (v P místě), hydrolýza t. RNAn-1 -peptid Uvolnění ribozómu Molekulární mimikry

Degradace m. RNA Poly(A) má ochrannou funkci Kompetice mezi translací a degradací m. RNA

Aminokyselina 21. - selenocystein Selenocystein: stop kodón (UGA) + další signál | (pyrrolysin) Zlomená m. RNA: ribosome rescue tm. RNA - tag, uvolnění ribozómu Eukaryota: poškozená RNA se vůbec neiniciuje

Shrnutí Genová exprese = 1. Transkripce (RNA pol. ) regulační elementy transkripční jednotky 2. RNA processing m. RNA (eukaryota) t. RNA, r. RNA (E. i P. ) 3. Translace (ribozómy) mimoribozomální fáze (ATP) ribozomální fáze (GTP) iniciace = nalezení 1. kodónu 4. Dále: posttranslační osud proteinů Rozdíly: Bakterie vs. eukaryota Souvislosti: Posttranslační osud proteinů VIDEO

Bakteria x Eukaryota • Odlišnosti se týkají především podoby m. RNA a odvozených procesů • Rozdílné složení (ne funkce) ribozómů - antibiotika • Důvod = odlišné životní strategie: 1) Bakterie - maximální reprodukce, rychlá odpověď na podnět, vnější podněty, nižší diverzita proteinů (stres, živiny) 2) Nižší eukaryota - určitá přechodová strategie 3) Metazoa - regulovaná reprodukce, kvalita odpovědi (spolupráce buněk, synchronizace), vnitřní podněty, evoluční náplava (ne všechny procesy a struktury jsou adaptivní), hodně různých proteinů (nutnost kompartmentace) Souvislosti: Regulace genové exprese

Bakteria x Eukaryota Bakterie Eukaryota Účel (E. ) 1 typ 3 typy regulace RNA processing současně odděleny úprava m. RNA nutnost (jádro) polycistronní monocistronní jemnější regulace kontrola kvality Úprava konců RNA ne ano kontrola kvality m. RNA Splicing + editing ne ano regulace RNA pol. Transkripce a translace m. RNA Každý proces/struktura/regulační obvod zvyšuje počet proteinů (genů) v buňce. Každý gen zatěžuje buňku (energie na expresi a replikaci, nové možné interakce atp. )

Poznámky Nestíhá se - vynechat speciality - editing, apod. Některé speciality přesunout k virů - např. ires Funkce a struktura