Posttranslan modifikace protein v regulaci BC Posttranslan modifikace
Posttranslační modifikace proteinů v regulaci BC
Posttranslační modifikace jsou běžnou záležitostí • Fosforylace transkripčních faktorů (viz jaderná lokalizace Swi 5 z minula) • Fosforylace CDK samotných • Ale fosforylací možnosti nekončí. . . vazba dalších podjednotek, ubikvitinace, degradace. . .
Fosforylace proteinů obecně - rekapitulace N C C R O CH 3 R C N HH CH A, Ala CH 3 F, Phe S, Ser CH 2 C O OH CH 3 OH C V, Val CH CH 2 O O H C H T, Thr OH Y, Tyr O O P O- OO- Q, Glu H, His
wee mutanti S. pombe wt cdc 2 -w wee 1: tyrosin kináza (. . . mik 1!) cdc 25: fosfatáza, opačný fenotyp! dvojitý mutant wee 1 cdc 25? ? (P. Nurse et al. )
Substrátem Wee 1 a Cdc 25 je CDK! cdc 25 cdc 13 (G 2 cyklin) wee 1/mik 1 cdc 13 (G 2 cyklin) cdc 2 Y 15 - P nim 1
CDC 25 obvod je evolučně starý (aspoň u opisthokont) • Aspergillus: Nim. T (Nim/Bim terminologie. . . ) • S. cerevisiae má. . . ale fenotyp? ? – na první pohled nic – ALE víc dvojjaderných buněk – kontrola kvality (pučení) • He. La: Y 15 F – předčas. vstup do mitosy!! • Xenopus: Y 15 P ace nutná pro blok mitosy po aphidicolinu • Rostliny? ? ?
(Simpson and Roger, Curr. Biol. 14: R 693, 2005)
Exprese kvasinkového Cdc 25 v rost. buňkách má fenotyp (Orchard et al. . Suchomelová, Lipavská. . . 2005)
CDC 25, Ostreococcus Score E Sequences producing significant alignments : gb|AAQ 16122. 1| dual specificity phosphatase Cdc 25 [Ostreoco. . . gb|AAH 02287. 1| Cdc 25 b protein [ Mus musculus] ref|NP_075606. 1| cell division cycle 25 homolog B [Mus musc. . . gb|AAH 57568. 1| Cdc 25 b protein [ Mus musculus] >gi|26335863|d. . . ref|XP_331695. 1| hypothetical protein [Neurospora crassa] >. . . ref|NP_598255. 1| cell division cycle 25 A [Rattus norvegicus. . . ref|NP_598256. 1| cell division cycle 25 B [Rattus norvegicus. . . gb|AAR 26469. 1| cell division cycle 25 B [Homo sapiens] >gi|1. . . gb|AAB 21139. 1| p 63 [Homo sapiens] ref|NP_068658. 1| cell division cycle 25 B isoform 2 [Homo sa. . . ref|NP_004349. 1| cell division cycle 25 B isoform 1 [Homo sa. . . gb|AAH 09953. 1| CDC 25 B protein [ Homo sapiens] >gi|11641413|r. . . ref|NP_997695. 1| cell division cycle 25 B isoform 5 [Homo sa. . . gb|AAP 36368. 1| Homo sapiens cell division cycle 25 B [synthe. . . emb|CAE 45909. 2| hypothetical protein [Homo sapiens] pdb|1 CWR|A Chain A, Human Cdc 25 b Catalytic Domain Without I. . . dbj|BAB 46915. 1| hypothetical protein [Macaca fascicularis] ( bits) Value 795 112 112 111 109 109 109 0. 0 2 e-23 4 e-23 1 e-22 1 e-22 1 e-22 94 93 92 8 e-18 1 e-17 3 e-17 . . . ref|XP_456705. 1| unnamed protein product [Debaryomyces hans. . . ref|XP_446231. 1| unnamed protein product [Candida glabrata]. . . emb|CAA 45885. 1| NIMT/CDC 25 [ Emericella nidulans] >gi|422216. . .
„CDC 25“, Arabidopsis Sequences producing significant alignments : pdb|1 T 3 K|A Chain A, Nmr Structure Of A Cdc 25 -Like Dual-Spec. . . gb|AAO 39886. 1| At 5 g 03455 [Arabidopsis thaliana] >gi|2645085. . . emb|CAB 83305. 1| putative protein [Arabidopsis thaliana] >gi. . . gb|AAM 63780. 1| unknown [Arabidopsis thaliana] ref|NP_912542. 1| Hypothetical protein [Oryza sativa (japoni. . . gb|AAU 11500. 1| rhodanese-like protein [Holcus lanatus] ref|NP_922597. 1| unknown protein [Oryza sativa (japonica cu. . . gb|EAA 75237. 1| hypothetical protein FG 05666. 1 [Gibberella z. . . gb|EAA 53924. 1| hypothetical protein MG 01909. 4 [Magnaporthe. . . ref|XP_502979. 1| hypothetical protein [Yarrowia lipolytica]. . . gb|EAA 58015. 1| hypothetical protein AN 6040. 2 [Aspergillus n. . . ref|XP_327252. 1| predicted protein [Neurospora crassa] >gi|. . . ref|XP_462481. 1| unnamed protein product [Debaryomyces hans. . . gb|EAL 22654. 1| hypothetical protein CNBB 1040 [Cryptococcus. . . gb|EAK 93619. 1| possible protein phosphatase [Candida albica. . . ref|NP_595247. 1| rhodanase domain protein [Schizosaccharomy. . . ref|NP_869856. 1| hypothetical protein RB 11227 [Rhodopirellu. . . gb|EAA 42885. 1| GLP_574_157368_157730 [Giardia lamblia ATCC. . . ref|YP_144680. 1| putative sulfurtransferase [Thermus thermo. . . ref|ZP_00282577. 1| COG 0607: Rhodanese-related sulfurtransfe. . . sp|P 27477|THTR_SYNP 7 Putative thiosulfate sulfurtransferase. . . gb|EAK 87236. 1| hypothetical protein UM 06379. 1 [Ustilago may. . . gb|AAP 10445. 1| Hydroxyacylglutathione hydrolase [Bacillus c. . . ref|NP_015526. 1| Arr 2 p [Saccharomyces cerevisiae ] >gi|45269. . . ref|YP_005018. 1| putative sulfurtransferase [Thermus thermo. . . ref|XP_448265. 1| unnamed protein product [Candida glabrata]. . . emb|CAA 45885. 1| NIMT/CDC 25 [ Emericella nidulans] >gi|422216. . . (chybí regulační doména? ) Score E ( bits) Value 273 271 268 175 170 169 70 68 67 66 62 56 53 52 51 46 46 45 44 44 44 43 42 42 7 e-73 3 e-72 3 e-71 2 e-43 8 e-42 2 e-41 1 e-11 7 e-11 1 e-10 2 e-10 3 e-09 3 e-07 2 e-06 4 e-06 9 e-06 2 e-04 3 e-04 4 e-04 9 e-04 0. 001 0. 003 0. 006 Landrieu et al. 2004
A to ještě není všechno: CDK mají i další fosforylační místa. Y 15 T 14 Y 15 T 161 Y 15 T 14 T 161 Y 15 cdc 25 T 14 T 161 wee 1 Y 15 T 161 cyklin
CAKs – CDK activating kinases Kvasinky: • S. pombe: – Mcs 6/Mcs 2 (CDK/cyklin) je CAK i CTD kin. – upstream CAKAK (monomerní) • S. cerevisiae: – monomerní CAK (Cak 1 p) – monomerní CTD kin (Kin 28 p)
A co rostliny? • Arabidopsis: – CAK 1 -CAK 4 – CAK 2, CAK 4 blízké CDK 7 – substrátem CTD i CDK – CAK 1 (CDKF): upstream od CAK 2, 4 (CAKAK!), komplementuje cak 1 ts Shimotohno et al. (incl. K. Bišová) 2004
CAK mezi rost. CDK Robbens et al. 2004
. . . a u živočichů exocytosis via NSF (PCTAIRE! – Liu et al. 2006) (Doerner lab 2005)
Rozdíly jsou v délce kinázové kaskády? S. pombe, metazoa, rostliny S. cerevisiae CAKAK CAK inaktivní kináza aktivní substrát CDK CTD
Degradace proteinů jakožto „extrémní modifikace“
Zpět k cyklovým hodinám kvasinek
Rekapitulace: transkripční regulační obvody pučivé kvasinky Swi 4, Swi 6 Mbp 1, Swi 6 Co brání současné aktivaci CLB a CLN? Amon et al. 1993
Mutanti S. c. s dlouhými pupeny a G 1 jádrem cdc 4, cdc 34, cdc 53
. . . a také všeobecný nedostatek CLB! (drženo na živu GAL: CLB 5) (Schwob et al. 1994)
Clb/Cdc 28 potřebuje k aktivaci ještě něco. . .
. . . co chybí v „dlouhopupenatých“ mutantech. (pozor na kontroly!!)
SIC 1 p 40 : inhibitor CDK • nalezen biochemicky • esenciální • ale dvojitý mutant cdc 34 sic 1 replikuje v pm • je cdc 34, cdc 53 třeba pro degradaci? ? ANO! • inhibitory CDK • degradace
Model
Sic 1 sám je regulován i transkripčně Jorgensen and Tyers 2000
Inhibitory CDK (CKI): CLB p 40 Sic 1 p 21, p 27 Kip 1 Cyc. A etc. Cdc 28 CDK 2/4 p 15 CDK 4 Cyc. D CDK 4
CKI a vstup do cyklu (živ. b. ) p 53 p 16 p 15 Cyc. D/CDK 4 p 21 p 27 Cyc. E/CDK 2 p. RB G 0/G 1 S
CDK inhibitory jakožto antionkogeny
Co jsou Cdc 4, Cdc 34, Cdc 53? ? Degradace proteinů zprostředkovaná ubikvitinací
Ubiquitin 76 aa, 8. 5 k. Da 96 % ident. člověk-kvasinka
CDC 34 = E 2!!!
E 3 – ubikvitin ligázy: SCF (Skp 1/cullin/F-box) Sic 1 Cdc 4 Cdc 34 NEDD 8= Rub 1 (related to ubiquitin) Cul 1 = cullin = Cdc 53!!
Jiné tváře SCF Sic 1 Cdc 4 TIR 1 Cdc 34 Neddylace: AXR 1 de. Neddylace: COP 9 signalosom auxin response fotomorfogeneze Cul 1 = cullin = Cdc 53!!, CUL 1
. . . degradace cyklinů. . .
Úloha CDK-cyklinových komplexů: co je třeba pro vstup do mitosy (G 2/M)? • Aktivace CDK vazbou „mitotických cyklinů“ (CLB, Cyc. A/B), tedy degradace CKI a cyklinů předchozí vlny? • Aktivace CDK fosforylací T 161 • Dereprese CDK defosforylací T 14, Y 15 • Ještě něco? ?
Jakou roli hraje degradace mitotických cyklinů? Rxx. Lxxxx. N „destruction box“ cyclin • Nedegradovatelný cyklin A, B • Nadprodukce „destruction boxu“ Metaphase arrest!! Je destrukce cyklinu nutná pro přechod Meta/Ana?
cyclin CDK metafáze CDK anafáze telofáze G 1
ALE: cdc 15! l. ND fenotyp Anafáze při vysoké hladině CLB/CDK!! (Surana et al. 1993)
. . . a nadbytek CLB blokuje v anafázi, ne metafázi! (Surana et al. 1993)
cyclin Cdc 15 CDK metafáze CDK anafáze telofáze G 1 . . . ALE předcházející pokusy s M blokem po inhibici degradace cyklinů!
Jak smířit modely? cyclin CDK metafáze X anafáze Cdc 15 CDK telofáze . . . a co tedy degraduje ty cykliny? ? G 1
CLB se nehromadí v buňkách bez CLN (Amon et al. 1994)
. . . a příčinou je specifická degradace!
. . . a navíc: • Obnova CLN kinázy stabilizuje CLB. • Model!
Mají „cyklové hodiny“ trojtaktní motor? (C KI no ne ) CLN CLB
- Slides: 46