V Filogenia Andrs Moreira Departamento de Informtica UTFSM

V Filogenia Andrés Moreira Departamento de Informática UTFSM

Construyendo árboles El objetivo del análisis filogenético es construir un árbol que refleje las relaciones evolutivas (a partir de un origen que se supone común) de un conjunto de objetos sobre los que se tienen datos. Los objetos pueden ser: • Las secuencias de un set de genes homólogos • Un set de genomas completos de bacterias • Una tabla de características observadas en fósiles de dinosaurios • Un set de idiomas, representados por vocablos • . . . etc.

Construyendo árboles Un posible árbol de los idiomas indo-europeos. El estudio de filogenia de idiomas es anterior a Darwin. De hecho, fue una inspiración para el pensamiento evolucionista. Post-Darwin, se aplicó la lógica de esos estudios a la clasificación de Lineo (en la que se reconoció una aproximación a la filogenia).

Construyendo árboles Algunos errores eran casi inevitables, como suponerle un origen común a los vertebrados de sangre caliente. Por suerte hoy en día podemos usar, en la mayoría de los problemas de interés, información genotípica: secuencias de DNA, RNA, o proteínas.

Construyendo árboles Algunas gracias de la información genotípica: • Discreta • Abundante (muchos bits por objeto) • La mayoría de las mutaciones son neutrales se acumula variación “gratis” es poco probable la convergencia (similaridad sin homología real)

Construyendo árboles Lo que hay que construir es un árbol: • Puede ser con raíz o sin raíz. E A C B • A veces la longitud de las aristas es relevante, y refleja distancia evolutiva. • Por lo general es binario, aunque puede haber “politomía” por falta de información o para simplificar. D

Construyendo árboles • La # de árboles posibles crece muy rápido. • Todos los criterios usuales para escoger un árbol dan problema NP-duros. . . heurísticas hojas árboles 3 1 4 3 5 15 6 105 7 945 8 10, 395 9 135, 135 10 2, 027, 025 11 34, 459, 425 12 654, 729, 075 13 13, 749, 310, 575 14 316, 234, 143, 225 15 7, 905, 853, 580, 625

Construyendo árboles Existen muchos softwares de filogenia computacional: Pero hay menos asociación algoritmo-software que en, digamos, MSA. De hecho los principales paquetes ofrecen todas las aproximaciones principales. Así que hablaremos en términos de esas.

Principales aproximaciones: • Métodos de distancias: trabajan sólo con una matriz de distancias entre los objetos. • Máxima parsimonia: se intenta minimizar la cantidad de cambios evolutivos implicados por el árbol. • Maxima verosimilitud: se incluye algún modelo de evolución, y de acuerdo con él –y los datos– se busca el árbol más probable.

Principales aproximaciones Según David Mount:

Datos Para resolver filogenia de especies, la información preferida dependerá del nivel de separación: • Para comparar primates es útil la mitocondria, porque acumula mutaciones rápido. • Para resolver las profundidades del árbol de la vida se usa RNA ribosomal, porque cambia lento.

• RNA ribosomal: fuerte conservación debido a estructura 2 d, 3 d, y a lo esencial de la molécula. • Nótese que el árbol de los tres dominios es sin raíz ; eso se debe a que no hay outgroup posible.

Outgroup “Outgroup” : método para ponerle raíz a los árboles: • Escogemos algo que sea con certeza pariente más lejano de los objetos en estudio, que ellos entre sí. • No demasiado lejano, para no agregar mucho ruido. • Una vez hecho el árbol, lo enraizamos en la rama que va hacia el outgroup. Otra forma de enraizar un árbol es agregar la hipótesis del “reloj molecular”: suponer tasa de mutación constante.

Filogenia y MSA • La mayoría de los métodos trabajan a partir de un alineamiento múltiple. • Por lo general se descartan las columnas con gaps. • Con frecuencia se alterna entre filogenia y alineamiento, usando uno como input del otro.

Métodos de distancia • Usan una matriz de distancias (por lo general sacada de un alineamiento). _ A A 0 B 4 C 6 D 10 E 10 • Pierden datos. B 4 0 4 8 8 • Reconstruyen la topología, y la longitud de las ramas. Supuesto: la distancia entre dos hojas es igual a la suma de las longitudes del camino entre ellas. C D E 6 10 10 4 8 8 0 6 6 6 0 4 6 4 0 D C A B E

Métodos de distancia: supuesto aditivo S 1 S 2 S 3 S 4 S 1 S 2 - D 12 D 13 D 14 - S 3 S 4 S 2 S 1 a b D 23 D 24 - D 34 d - S 3 e S 4 Distancia en el árbol Distancia observada D 12 D 13 Objetivo: D 14 D 23 D 24 D 34 c d 12 d 13 d 14 d 23 d 24 d 34 = = = a a a d c d + + + b d b b e b + c + e

Métodos de distancia: Neighbour Joining C B b c a A NJ: El método de distancia más popular. Idea: Cuando tenemos sólo 3 ramas, se puede resolver: d(A, B)=a+b d(A, C)=a+c d(B, C)=b+c a = ½ [ d(A, B) + d(A, C) - d(B, C) ] b = ½ [ d(A, B) - d(A, C) + d(B, C) ] c = ½ [ -d(A, B) +d(A, C) + d(B, C) ]

Métodos de distancia: Neighbour Joining C B b c a A d D Empezamos con una estrella (es el peor caso!), y vamos uniendo. e C B b E • Unimos A y B a un nuevo nodo. • Juntamos en “X” todo lo demás. • Definimos d. AX como el promedio de las distancias entre A y los elementos de X. • Ahora aplicamos el caso de tres nodos, a los nodos a, b y X. A a c x d D e E X

Métodos de distancia: Neighbour Joining d. AN = a = ½ (d. AB+d. AX-d. BX) Para las distancias entre el nuevo y el resto, suponemos aditividad y promediamos lo que dan A y B: d. CN = ½(d. CA-d. AN) + ½(d. CB-d. BN). . . etc d. BN = b = ½ (d. AB+d. BX-d. AX) C B b A a c x d D e E • Se aplica esa idea repetidamente. • Para escoger cuáles unir, se aplica una estrategia glotona, que escoge los que reduzcan más la suma de las ramas. X

Métodos de distancia Más detalles, y otros métodos de distancia: en ppt full. Ventajas de los métodos de distancia: • Son rápidos • Se adaptan bien a ramas de longitudes distintas Desventajas: • Pierden información • Dependen del supuesto de la aditividad la forma en que se calcula la distancia es vital

Distancias Forma trivial de evaluar distancia: n : # de columnas que uso del alineamiento nd : # de columnas en que las dos secuencias son ¿Qué puede fallar con eso? Puede haber cambios más probables que otros (incorporar información de matrices de sustitución) Si ha pasado mucho tiempo, algunos sitios van a haber mutado más de una vez.

Se introducen correcciones. La más simple, de Poisson: En general la corrección depende un asumir un modelo de evolución de la secuencia (como una matriz PAM). Es toda una ciencia; no veremos más.

Máxima parsimonia, o mínima evolución: Busca el árbol, coherente con los datos, que requiere menos eventos evolutivos. • Es el método más intuitivo, simple y general • Pero: se porta bien con pocos datos (es caro) y cercanos (poca distancia evolutiva). • Se consideran los “caracteres” de a uno. • “Caracter”: columna del alineamiento, o rasgo morfológico, o cualquier atributo en realidad.

Máxima parsimonia • Para un árbol dado (sin raíz) y un caracter dado, evaluamos la cantidad mínima de cambios que sea coherente con ese esquema. G A A A G A C A A • Evaluar eso es barato (polinomial). • Para el conjunto de caracteres disponibles, sumamos los valores, y eso le da un score al árbol.

Máxima parsimonia • Hay posiciones que no permiten discriminar entre árboles, no interesan. • Para ser informativa, una columna del alineamiento tiene que tener al menos dos letras que estén al menos dos veces. G G A G G C A A A C T G C C T T * T T G G C C * A C A G C A A A A A

Máxima parsimonia La parte difícil (lo NP-duro!) es encontrar el árbol que minimice la suma de los scores. • Si son pocas hojas, se hace exhaustivo. • Si son más, pero tampoco taaantas (digamos, < 20): branch & bound. • De ahí para arriba, heurísticas. Se parte de varios posibles árboles, y se recorre haciendo simulated annealing o hill climbing. Se usa un set de árboles “vecinos” de un árbol dado, vía alguna transformación.

Máxima parsimonia Un algoritmo glotón: • Parto con un árbol de tres hojas. • Voy agregando hojas de a una. • Al agregar una hoja, escojo la forma de hacerlo que aumente menos el score. Se puede hacer en O(n 2 N) [n secuencias, de largo N], Se puede usar como punto de partida de heurísticas, probando distintos órdenes de agregado.

Máxima parsimonia Un ejemplo de transformación de árbol, Nearest Neighbor Interchange (NNI): Para cada arista interior, pruebo las otras dos formas de armar el cuarteto centrado en ella. Hay otras dos transformaciones frecuentes; ver ppt full.

Máxima parsimonia Ventajas de MP: • Es fácil de aplicar a datos no genómicos. • Es fácil poner ponderaciones distintas a los caracteres. • Se puede exigir un orden a los cambios (ej. , “cola corta/mediana/larga”). • Provee secuencias ancestrales.

Máxima parsimonia Desventajas: • Lento. • No usa toda la información (sólo sitios informativos). • No da información sobre la longitud de las ramas. • No hay corrección para mutaciones múltiples; no hay modelo de evolución asociado. • No es estadísticamente consistente: tiene sesgos en que agregar datos no ayuda.

Máxima verosimilitud (ML, por max. likelihood) combina la idea de MP con los modelos de evolución de caracteres (Jukes-Cantor, etc. ). • También usa heurísticas para recorrer los árboles posibles. • Es aún más lento que MP. • Pero como permite tasas de evolución distintas por rama, e incorporar distancia evolutiva entre caracteres (Jukes-Cantor, PAMs, etc), es más general y robusto. Y usa mejor los datos.

Máxima verosimilitud Lo que cambia respecto a MP, es lo que le evaluamos a cada árbol candidato. En MP: queremos el árbol con menos evolución. En ML: queremos el árbol más probable. ML evalúa la verosimilitud L (probabilidad relativa) del árbol, y busca maximizarla. ¿Cómo la evalúa? L(árbol) Probabilidad( datos / árbol )

Máxima verosimilitud Usa un modelo de evolución: • Probabilidades de sustituciones • Frecuencias de caracteres (en “background”) Lo desconocido: • El árbol • La longitud de las ramas Los árboles, los recorre como en MP. Para cada árbol, determina longitud óptima de las ramas, y con eso y el modelo de evolución, calcula L.

Máxima verosimilitud Al igual que en MP, se asume independencia entre las distintas posiciones del alineamiento. Por lo tanto, P(datos/árbol) se calcula como el producto de P(columna/árbol), sobre todas las columnas. (O más bien, como se juntan números muy chicos, se toman los logs y se suman).

Máxima verosimilitud Evaluemos L(j), dado un árbol y suponiendo que conocemos las longitudes de las ramas. ¿Cuál es la probabilidad de que ese árbol genere la columna j? • Enraizamos el árbol • Hay que considerar todas las posibles letras en (5) y (6).

Máxima verosimilitud • Para cada caso, el modelo y la longitud de las ramas me dan, en cada rama, una probabilidad. • Las multiplico y tengo la de ese caso. • Sumo las de todos los casos, y tengo la probabilidad de los datos, dada esa topología, ese modelo y esas longitudes.

Máxima verosimilitud Eso, suponiendo que conozco las longitudes de las ramas. Lo que se hace es escoger (con métodos de optimización numérica, tipo Newton-Raphson) las longitudes que maximizan L. Eso es ML clásico (Felsenstein). Existen variantes. PHYML (Guindon & Bascuel, 2003) es muy popular, y alterna entre modificar ramas y modificar la topología del árbol; es un tipo de algoritmo EM.

Hasta aquí Métodos de distancias (digamos, NJ) Máxima parsimonia (MP) Máxima verosimilitud (ML) Usa sólo distancias Usa sólo caracteres “informativos” Usa todos los datos Minimiza suma de ramas Minimiza eventos evolutivos Maximiza la verosimilitud del árbol, dado un modelo de evolución. Rápido Lento Muy lento Asume aditividad, y además es heurístico. Falla con ramas largas o muy disímiles Depende harto del modelo de evolución que se use. Bueno para árboles tentativos, y solución casi inevitable cuando hay muchas hojas. Mejor opción cuando sus supuestos se aplican y hay pocas (<20) hojas Bueno para conjuntos de muy pocas secuencias. O para evaluar y/o iterar sobre un árbol generado por otro algoritmo.

Significatividad ¿Qué confianza podemos tener en un árbol filogenético? Lo que se suele hacer es bootstrapear: • Resamplear (con reemplazo) las columnas del alineamiento, obteniendo así un nuevo alineamiento • Calcular un árbol a partir de ese alineamiento. • Hacer eso unas 100 ó 1000 veces. 1 2 3 4 5 6 7 8 A G C A T T T B G C A T C G C A C C T D G C A C C T T T 1 2 3 4 5 6 7 8 A G G A A T T B G G C A T C C T C G A C C T D G A C C T T

Significatividad

Significatividad Hacemos un árbol de consenso. Le asociamos a los nodos interiores el % de veces que aparecieron (con los mismos hijos) en los árboles del bootstrap. 70 80 100 95 100

Árbol de consenso Es una forma de combinar un conjunto de árboles, en un único árbol. Idea: si un clado está apoyado por una mayoría de los árboles, entonces el clado se incluye en el árbol de consenso. Combinando los distintos clados, se define el árbol completo, o casi (puede no quedar binario). Detalles técnicos: en ppt full o en libro de Clote. Backofen.

Muchas revistas exigen que los árboles filogenéticos vayan acompañado por valores de bootstrap.

Qué pasó ahí? Las plantas quedan agrupadas con las bacterias! Explicación: adquirieron el gen por transferencia horizontal desde sus cloroplastos.

Ejemplos de usos del análisis filogenético Durante un siglo hubo discusión sobre qué eran los osos pandas: parecen osos, pero no hibernan. En algunos rasgos, se parecen más a los mapaches. 1985: caso resuelto, con datos moleculares.

Ejemplos de usos del análisis filogenético Inferencia de función a partir de filogenia

Ejemplos de usos del análisis filogenético Concordancia entre especies: pistas para el diseño de estrategias de conservación.

Ejemplos de usos del análisis filogenético Lafayette, Louisiana, 1994. • Una mujer acusó a su ex-amante (un gastroenterólogo) de haberle inyectado sangre con SIDA. • Había registro de que en esa fecha el acusado sacó sangre a un paciente seropositivo. • La defensa alegó coincidencia. El virus del SIDA (HIV) es altamente variable. De hecho, su juego contra el sistema inmune es evolutivo. Se usaron dos genes del HIV, y tres métodos de reconstrucción filogenética.

Ejemplos de usos del análisis filogenético P: paciente V: víctima LA: otros pacientes seropositivos de la zona Caso resuelto. Acusado culpable! Todos los detalles sórdidos: Molecular evidence of HIV-1 transmission in a criminal case M. Metzker et al, PNAS (2002) doi : 10. 1073/pnas. 222522599

Desafíos actuales Sólo algunos de los principales: • Tradicionalmente se ha trabajado con pocos genes en muchas especies, o muchos genes en pocas especies. Crecientemente, son muchos en muchas. • Transferencia horizontal de genes: ahí no sirven los árboles, hay que pensar en redes. • Filogenia de genomas completos: importa el contenido de genes, y el orden en que están.

Para saber más • El Ppt full. • Los capítulos en los libros de Mount y de Clote. . . pese a ser incompletos; de hecho, casi no tienen intersección. • Un review muy completo y bueno aunque un poco viejo: PHYLOGENETIC ANALYSIS IN MOLECULAR EVOLUTIONARY GENETICS Masatoshi Nei Annual Review of Genetics Vol. 30: 371 -403 (1996) doi : 10. 1146/annurev. genet. 30. 1. 371