Thse Prsente par Thomas Polack Spectroscopie infrarouge impulsionnelle

Thèse Présentée par Thomas Polack Spectroscopie infrarouge impulsionnelle appliquée au transfert de ligands dans les hémoprotéines préparée au Laboratoire d’Optique et Biosciences Directrice de thèse Antigoni Alexandrou

Plan de la présentation • Transfert de ligands dans les hémoprotéines • Différentes approches expérimentales • Expériences pompe-sonde spectralement intégrées • Résultats expérimentaux • Analyse et Interprétation • Détection du champ émis • Mise en oeuvre • Expérience • Conclusions et Perspectives

Plan de la présentation • Transfert de ligands dans les hémoprotéines • Approches expérimentales • Expériences pompe-sonde spectralement intégrées • Résultats expérimentaux • Analyse et Interprétation • Détection du champ émis • Mise en oeuvre • Expérience • Conclusions et Perspectives

Transfert de ligands • Transport, stockage, catalyse enzymatique, détection de ligands • Liaison du ligand à l’hème → fonction de la protéine • Dynamique du transfert du ligand site de liaison ↔ extérieur • Sonder le transfert : • rayons X • absorption transitoire visible F. Schotte, M. Lim, T. A. Jackson, → transitions électroniques de l’hème A. V. Smirnov, J. Soman, J. S. Olson, G. N. Phillips Jr. , M. Wulff, • absorption transitoire infrarouge P. Anfinrud, Science 300, 1944 → vibration du ligand (2003).

Motivations • Compréhension du processus de transfert entre la poche de l’hème et l’extérieur de la protéine → Premières étapes du transfert • Accès aux caractéristiques vibrationnelles du ligand aux temps courts • Détection du champ émis : intervention de mouvements concertés dans le processus de transfert

Myoglobine : de l’hème au docking-site Olson et al. Biochemistry (1994) Elber et al. Biophys. J. (1998) B 1 Côté distal O C Transfert Côté proximal CO lié à l’hème CO au docking-site Dissociation déclenchée par une impulsion pompe visible dans la bande de Soret à 400 nm.

Caractéristiques infrarouges du transfert Δα Ligand CO CO lié à l’hème • Vibration en dehors du continuum des autres modes vibrationnels de la protéine • Forte absorption Modification de la vibration • 1945 → 2130 cm-1 • Diminution force d’oscillateur d’un facteur 30 • Changement d’orientation • Temps de déphasage ~1 ps Anfinrud et al. J. Chem. Phys. (1995) Δα CO sur le docking-site ┴ ║ B 1 B 2 Anfinrud et al. , Nat. Struct. Biol. (1997)

Effets de polarisation perturbée • T 2 ~1 ps • Délai pompe-sonde négatif • Polarisation perturbée par la pompe • Oscillations spectrales • Dynamique aux temps courts Domaine temporel Polarisation P M. Joffre et al. Opt. Lett. 1988. DP Polarisation perturbée par la pompe Domaine spectral • Transmission différentielle intégrées spectralement → signal faible • Détection du champ émis

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Montage expérimental Verdi 10 W OPA 1. 2 -2. 4 µm 100 n. J BBO 4 µJ 6 µJ Reg. A 200 k. Hz, 150 100 150 fsfs Coherent Regen. Amplificateur Régénératif BBO Signal BBO l/2 Délai pompe-sonde Ds = 100 cm-1 Détecteur Hg. Cd. Te IR Pompe 400 nm 200 fs 250 n. J Idler 800 nm, 5 n. J Vitesse Mira Coherent 80 MHz, 100 fs Oscillator Oscillateur Ag. Ga. S 2 Différence de fréquence 3 -18 µm, 250 fs, 40 p. J Interféromètre Translation-Rotation de l’échantillon

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Premiers résultats expérimentaux 4 3. 5 5 DT/T x 10 • Intégration spectrale • Faible signal 3. 0 2. 5 2. 0 1. 5 1. 0 0. 5 Nécessité d’améliorer du rapport signal à bruit 0. 0 -0. 5 -1. 0 -1. 5 -1. 0 -0. 5 0. 0 0. 5 1. 0 1. 5 Délai pompe-sonde (ps) 2. 0

Montage expérimental Verdi 10 W OPA 1. 2 -2. 4 µm 100 n. J BBO 4 µJ 6 µJ Reg. A 200 k. Hz, 150 100 150 fsfs Coherent Regen. Amplificateur Régénératif BBO Signal BBO l/2 Délai pompe-sonde IR Pompe 400 nm 200 fs 250 n. J Idler 800 nm, 5 n. J Vitesse Mira Coherent 80 MHz, 100 fs Oscillator Oscillateur Ag. Ga. S 2 Détecteur Hg. Cd. Te Interféromètre Translation. Rotation de l’échantillon

Détection différentielle infrarouge Laser (100 k. Hz) • Hacheur mécanique haute fréquence • Intensité de référence Faisceau pompe 50 k. Hz Intensité de référence Ag. Ga. S 2 IR Détection synchrone Détecteur Hg. Cd. Te Intensité sonde transmise Echantillon

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Intensité (unités arbitraires) Sondes Infrarouges et absorption du ligand 2 1 3 CO lié à l’hème 1700 Sonde Ds = 100 cm-1 1800 CO sur le docking site 1900 2000 2100 2200 1945 d’onde 2130 nombre ( cm-1)cm -1 2300 Nombre d’onde

Transmission différentielle dans Mb. CO -4 1. 5 x 10 1 2 Fréquence finale 2120 cm-1 -ΔT/T 1 ║ 0. 5 0 -0. 5 -1 -1. 5 3 1945 ║ 2130 Fréquence intermédiaire 2060 cm-1 Aucun signal observé dans deoxymyoglobine ┴ Fréquence initiale 1945 cm-1 -2 Pompe 400 nm Sonde IR -1500 -1000 -500 1000 1500 2000 0 Délai pompe-sonde (fs)

Absorption différentielle -4 Fréquence finale Fréquence initiale Angle Magique Pompe 400 nm Sonde IR

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Simulations Modèle Phénoménologique : • Polarisation induite linéairement par la sonde • Modèle à 2 niveaux équations de Bloch • Variation • fréquence • force d’oscillateur • temps de déphasage • orientation 1900 2000 2100 2200 Nombre d’onde (cm-1)

Changement instantané de force d’oscillateur -4 D Expérience Fréquence finale Simulation Fréquence initiale → Changement abrupt de la force d’oscillateur n’est pas compatible avec l’expérience

Changement progressif de force d’oscillateur -4 D Expérience Fréquence finale Simulation Fréquence initiale → Temps caractéristique de la diminution de la force d’oscillateur : 400 fs

Changement de fréquence vibrationnelle progressif -4 D Expérience Fréquence finale Fréquence initiale → Moins bon accord avec les expériences Simulation

Effet d’un élargissement spectral -4 Avec élargissement D Sans élargissement Fréquence finale Fréquence initiale → Influence faible pour un élargissement inférieur à la largeur du spectre de sonde

Expériences intégrées spectralement • Changement de fréquence quasiinstantané • Diminution progressive de la force d’oscillateur • Faible influence de l’élargissement spectral • Nouvelle observation • Compatible avec les résultats de Anfinrud et al • Indicateur de la distance Hème-CO • Nécessité de calculs de force d’oscillateur → Utilisation de la force d’absorption comme sonde du transfert

Plan de la présentation • Transfert de ligands dans les hémoprotéines • Approches expérimentales • Expériences pompe-sonde intégrées spectralement • Résultats expérimentaux • Analyse et Interprétation • Détection du champ émis • Mise en oeuvre • Expérience • Conclusions

Champ transmis et Champ rayonné Transmission |ET EIncident ETransmis 2 | ET = E I + ER t Champ émis ER ERayonné

Expériences de détection du champ émis EPOMPE t Eexcitation Eréférence Nécessité d’un contrôle de la phase fref - fexc

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Montage expérimental Verdi 10 W OPA 1. 2 -2. 4 µm 100 n. J BBO 4 µJ 6 µJ Reg. A 200 k. Hz, 150 100 150 fsfs Coherent Regen. Amplificateur Régénératif BBO Signal BBO l/2 Délai pompe-sonde IR Pompe 400 nm 200 fs 250 n. J Idler 800 nm, 5 n. J Vitesse Mira Coherent 80 MHz, 100 fs Oscillator Oscillateur Ag. Ga. S 2 Détecteur Hg. Cd. Te Interféromètre Translation-Rotation de l’échantillon

Montage expérimental Ag. Ga. S 2 tt échantillon Ag. Ga. S 2 • Deux générations IR • Phase relative difficile à stabiliser Détecteur Hg. Cd. Te Modification de la configuration expérimentale

Montage expérimental fpompe Ag. Ga. S He. Ne 2 échantillon PZT Détecteur Hg. Cd. Te Détection synchrone fexcitation Microcontrôleur • Impulsion de référence engendrée dans le même cristal • Interferomètre asservi → Impulsions vérrouillées enphase vérouillées en • Détection synchrone à la somme de fréquence fpompe + fexcitation

Deux approches possibles Détection homodyne référencée j t Détection homodyne auto-référencée → facilité de mise en oeuvre d Dt - w 0 t Df = w 0 Dt t Df = 0 Df = p/2

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Expérience de détection du champ émis Expériences de détection du champ émis pompe excitation référence 500 fs t t • Changement avec la phase • Contribution pompe-sonde Impulsion excitatrice

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Conclusions • Expériences pompe-sonde spectralement intégrées • Mesure l’absorption intégrée et le décalage en fréquence • Expérience adaptée aux grands changements de fréquence > 100 cm-1 (myoglobine) • Mise en évidence d’une décroissance non-instantanée de la force d’oscillateur, c’est une nouvelle observation • Utilisation de cette force d’oscillateur comme sonde du transfert • Expériences de détection du champ émis • Démonstration expérimentale • Expérience adaptée aux faibles changements de fréquence et transfert cohérent

Perspectives • Etude du transfert de ligand dans diverses hémoprotéines à l’aide des méthodes développées • Expérience de détection du champ émis dans la cytochrome c oxydase n. Fe=1962 cm-1 → n. Cu=2062 cm-1 Ursula Liebl and Gérard Lipowski and Michel Négrerie and Jean-Christophe Lambry and Jean-Louis Martin and Marten H. Vos, Nature 401 (1999)