La Spectromtrie de masse Un outil de pointe

La Spectrométrie de masse: Un outil de pointe à la portée de tous

Histoire � 1897 Sir J. J. Thomson (Cavendish Laboratory of Cambridge) � Prix Nobel de Physique 1906 � Arrivée dans les laboratoires de diagnostic clinique dans les années 80 -90

Généralités � Technique analytique physique permettant de séparer des molécules sous forme d’ions suivant leur rapport masse/charge (m/z) � Intérêt : - Détermination de masse moléculaire - Identification structurale - Quantification

Structure d’un spectromètre de masse (MS)

Structure d’un spectromètre de masse (MS) � Fonction de la source d’ionisation: Molécules neutres Ions + - � Plusieurs types: - Ionisation douce: Electro. Spray Ionization (ESI), Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI), Chemical Ionization (CI) - Ionisation dure: Electronic Impact (EI)

Structure d’un spectromètre de masse (MS) � Fonction: sélectionner les ions selon leur rapport m/z + + � Plusieurs types d’analyseurs: � � Quadrupôle Temps de vol (TOF) � Combinable entre eux: Triple quadrupôle, Q-TOF, TOF-TOF…

Structure d’un spectromètre de masse (MS) e- + + + � Fonction: détecter et compter les ions produits par la source et transmis par l’analyseur � Plusieurs types de détecteurs existent +/- sensible et durable

Structure d’un spectromètre de masse (MS) �Fonctions: � Gérer la communication avec les modules de l’appareil � Traduire les données du détecteur en Spectre de masse � Identifier les molécules (via la banque de données) et/ou les quantifier

Couplage à la chromatographie GC/LC Intérêt : Décomplexifier le mélange ↑ Spécificité (intérêt +++ si matrice = sang / urine) ↓ Interférences � 2 types de chromatographies: � Chromatographie Phase Gaz (GC): adaptée aux petites molécules volatiles <600 -800 Da (GC-MS) � Chromatographie Phase Liquide (HPLC ou UPLC) adaptée aux molécules de polarités différentes (LC-MS)

Exemple d’un GC-MSMS en mode MRM Q 1 Fixe Precursor ion Cellule de Collision Q 2 Fragmentation Q 2 Fixe Product ion Exemple: Pour la créatine la transition MRM est 188>90 (Da)

Au quotidien : Démarrage Les maintenances de l’appareillage: Plusieurs niveaux de formation = plusieurs niveaux de qualification Maintenance LC / MS Technicien Fréquence Formation référent / utilisateur Ingénieur Changement phase mobile + Colonne Quotidienne Rapide Nettoyage entrée source d’ionisation Quotidienne Rapide Amorçage + Mise en équilibre du système + rinçage injecteur Quotidienne Rapide Contrôle du fonctionnement du système / identification de panne Quotidienne Moyenne Intervention pompe LC / injecteur Curative 2/an Moyenne Calibration Analyseur après PM Curative Moyenne

Au quotidien � Screening/identification : Mélange test � Dosages : � Calibration en 3 points minimum � Passage de contrôles encadrant la série de patients � Logiciel de gestion des contrôles � Points importants : � Matrice CAL et CQ en rapport avec l’échantillon � Etalons internes marqués s’ils existent

Etalon interne � Molécule(s) connue(s) ajoutée(s) en concentration connue en début de manipulation. � Sa réponse mesurée permettra de : � Compenser les fluctuations analytiques (préparation, injection, détection) Quantification : Aireanalyte/Aire. EI � Témoigner du bon déroulement de l’analyse du début de la manipulation jusqu’à la détection de l’analyseur.

Etalon interne � Compatible avec le traitement de l’échantillon (précipitation, extraction liquide, solide, …) � Comportement et propriétés physico-chimiques similaires à la molécule analysée. Molécule Native: Isotope marqué : O-toluidine MM = 107 g/mol O-toluidine D 9 MM = 116 g/mol ΔM= 9 Da

Etalon interne � Ex : Lacosamide quantification Temps de Rétention similaires : Ø Repère Ø Ionisation identique Lacosamide qualification Lacosamide d 3

Applications: � Toxicologie: Screening large et/ou dosage de différents xénobiotiques (médicaments, stupéfiants, marqueurs d’exposition professionnels, métaux…) Intérêt +++ en médecine légale � Métabolisme: Etablissement de profils métaboliques / dosage des métabolites endogènes (Acides aminés, Acides organiques, Acylcarnitines, Acides gras, Acides biliaires, Créatine et Guanidinoacétate) � Microbiologie: Identification des souches bactériennes � Immunologie: Dosage des immunosuppresseurs (anti-rejet tel que Everolimus) � Endocrinologie: Dosage des stéroïdes sanguins et urinaires, dosage de la Vitamines 1, 25 OH D 2 ou D 3

Métabolisme � Exemple de la chromatographie des acides organiques urinaires en GCMS/Détecteur à ionisation de Flamme (FID): � Traitement de l’échantillon � Injection de l’extrait sur le GC Chromatogramme + Spectres de masses � Etablissement du profil qualitatif en MS Diagnostic clinique � Quantification des métabolites d’intérêt en FID Diagnostic + Suivi

Métabolisme

Métabolisme basal

Métabolisme Marqueurs spécifiques de la pathologie Activation de voies métaboliques secondaires

Métabolisme

Endocrinologie: � Evolution des méthodes immunologiques / Radio-immunologiques vers la LC-MSMS: � ↑ spécificité +++ car éviction des réactions croisées Ag/Ac � ↑ sensibilité +++ (résultat au ng/ml) � ↓ coûts : kits ELISA, RIA €€, élimination des déchets radioactifs €€€ , possibilité de regroupement des analyses en profil � ↓ volume de sérum nécessaire chez les nouveaux nés car profil établi en 1 seule prise d’essai (300 µL)

Endocrinologie:

Microbiologie � Utilisation d’un MALDI-TOF en routine pour l’identification des souches bactériennes � Co-cristallisation de la matrice avec une colonie bactérienne isolée

Microbiologie � Etablissement d’un spectre des protéines de la souche bactérienne � Comparaison avec les spectres de la banque de données (fournie par le fabricant)

Validation de méthode de dosage � Linéarité : Modèle linéaire, quadratique, … � Limites méthode : LOD/LOQ et limite de linéarité haute � Répétabilité : même série, même opérateur � Fidélité intermédiaire : Reproductibilité inter-série… � Contamination inter-échantillons � Sélectivité / interférences � Justesse � Incertitudes (CV)

Préparation d’échantillon • Intérêt: dépend de la molécule et de son environnement • Elimination de substances: - Augmentant le bruit de fond (interférents) - Modifiant la réponse (effet matrice) - Encrassant l’analyseur (Polluants) • Concentration (si recherche de sensibilité) • Mise en condition de l’analyte pour le rendre analysable (dérivation, transfert dans un solvant compatible avec analyseur, co-cristallisation pour MALDI…)

Préparation d’échantillon Dosage de CAO en GC/MS-FID: - 1 m. L d’urine (ou dilution si Créatinine >1 m. M) 30 µL de solution d’étalons internes (2 -Phenylbutyrate+ C 17: 0) 200 µL HCL 2, 4 N Na. Cl jusqu’à saturation Triple extraction Liquide / Liquide à l’Acétate d’éthyle (Agitation 1 min, Centrifugation, décantation) Evaporation de la phase organique Dérivation 45 minutes à 80°C Run = 45 min Temps de traitement des données: 20 -30 minutes

Préparation d’échantillon Dosage de metformine : - 50 µL de sérum 300 µL de précipitant + étalon interne Centrifugation 10 min à 20 000 g Reprise de 20 µL de surnageant + 180 µL de PM Run = 3 min - Tps 1 échantillon < 15 min - Tps 10 échantillons < 25 min Ø Intérêt fonctionnement en série

Dosage Tableau de résultats Possibilité transfert SIL Transition de quantification Transition de qualification Transition de quantification EI Calibration Transition de qualification EI

Conclusion � Technique de référence pour de nombreux dosages � Outil indispensable en laboratoire d’analyses médicale Ø gain de spécificité et sensibilité � Maintenance de base et utilisation accessible � Avenir : métabolomique, protéomique…

Merci de votre attention!